甘肃地区汉族HCV基因分型相关分析

目的调查甘肃地区汉族丙型肝炎病毒（HCV）基因分型分布情况及与其可能的传播途径、其他相关临床指标之间的关系。方法收集甘肃地区汉族220例患者完整数据,包括性别、年龄、可能的感染途径、病毒水平及生化检查。计量资料采用t检验以及秩和检验分析,计数资料采用卡方检验,采用多因素Logistic回归分析研究HCV基因型与临床的相关性。结果220例患者共检出1b型84例（38％）,2a型136例（62％）。对220例不同HCV基因型感染者的年龄、性别、感染途径、HCVRNA、ALT、AST、TBil、IBil、DBil、ALP、GGT等11项观察指标进行单因素分析结果表明,感染途径、HCVRNA及A¨与HCV基因型问存在相关性（Ⅳ0=23．947,P〈0．001;Z=一3．349,P=0．001;t=-2．325,P=0．021）,而年龄、性别、AST、TBil、IBil、DBil、ALP、GGT等指标均与HCV基因型无关（P〉0．05）。再经多因素Logistic回归分析显示,该3项均与HCV基因型有关（矿=3．993,P=0．046;矿=9．308,P=0．002;x^2=11．652,P=0．001）。Logistic回归分析结果显示HCVRNA高水平复制（≥10^6）患者中感染2a型较1b型患者多;ALT异常（〉49U／L）患者中感染2a型者较之感染1b型患者多;通过输血途径、口腔感染途径感染1b型的概率,较之其他途径高。结论甘肃地区汉族人群中HCV感染主要为基因1b型及2a型,且2a型较1b型更为常见。2a型患者更容易出现HCVRNA的高水平复制,且可能更容易出现肝脏损伤。输血途径感染是甘肃地区主要感染HCV的方式,其次为口腔感染,而通过以上2种感染方式感染HCV的患者1b型较2a型多。     

中国地区HCV株包膜区cDNA序列变异性分析

目的　研究国内不同地区ＨＣＶ包膜基因区变异。方法　对国内不同地区慢性丙型肝炎患者的１３株 ＨＣＶ采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增ＨＣＶ包膜基因区（Ｅ１、 Ｅ２／ＮＳ１）片段，对其中的１００５ｂｐ的ｃＤＮＡ进行测序，并与 国内外株进行变异性分析。结果　国内ＨＣＶ株比较，同型（Ⅱ）间该区核苷酸和氨基酸的同源性分别介于７６．４２％～ ９７．１１％和７５．２２％～９３．１５％，不同型（Ⅲ）间分别为６２．２９％～６３．３８％和５１，２９％～６０．００％；国内与国际同型株比较，同型 （Ⅱ）间分别为７３．７３％～８７．７６％和７５．８２％～８８．０９５％，不同型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）间分别为６１．４９％～８１．４９％和４９．３５％～７８．２１％；国 内外１８株ＨＣＶ的ＨＶＲ１区同源性仅为３６．１１％～７５、３１％和２０．８０％～６２．９６％，发现两个新的较高变异区（第２５０～２５７ 位和第４４３～４６５位氨基酸）。结论　ＨＣＶ包膜区序列分析同型间同源性较高，异型间同源性较低；南北地区有差 异，国内外差异更大；最大的变异在ＨＶＲ１，并发现两个新的较高变异区。     

全长乙型肝炎病毒基因组的扩增及序列分析

目的 建立一种全长乙型肝炎病毒(HBV)基因组扩增及序列分析的新方法。方法 在HBV负链开环缺口处设计引物，使用TaKaRa LA Taq^TM DNA聚合酶进行扩增，聚合酶链反应产物克隆后进行全长序列测定。结果 用此方法成功获得HBV全基因组DNA序列。将已知序列的HBV全基因组重组质粒作为模板进行敏感性和保真性测定，其敏感性为10^2个初始模板，核苷酸的人为突变率为1．2bp／kb。结论 此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析，为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

西安及周边地区HCV基因型构成分析

正HCV可分为6个主要类型(1、2、3、4、5和6型),每个类型又可以继续分为多种亚型[1]。HCV基因组高突变率的特点极大的阻碍了疫苗及治疗性抗体的研发。中国现行HCV标准治疗方案主要依赖于聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林[2],但随着新的直接抗病毒药物(direct acting antiviral agents,DAA)的研发及临床运用,病毒清除率得到极大的提高,HCV NS5蛋白酶抑制剂——索非布韦(sofosbuvir)能够有效抑     

丙型肝炎病毒1a、1b和2a型E1E2原核质粒的构建和序列分析

目的构建陕西地方株丙型肝炎病毒(HCV)1a、1b和2a型包膜糖蛋白E1E2的原核质粒并测序比对。方法采用逆转录-巢式聚合酶链反应(RT-nest PCR)扩增获得HCV 1a、1b和2a型E1E2片段,与p MD-18 simple vector连接,转化感受态细菌DH5α,小量提取质粒DNA并测序。测序结果与Gene bank中其他标准序列比对以获取同源性数据。同时重点分析E2蛋白高变区(HVR)1和2氨基酸序列。MEGA 4软件绘制种系进化树图。结果成功扩增约2 kb的目的片段并构建原核质粒,测序结果正确。1b亚型E1E2的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。HCV E2的HVR1和2的序列比对显示,同种基因亚型在HVR 1的变异性最大,而HVR 2的序列变异性不显著。不同基因亚型的毒株在HVR 1和2的变异性极大,而1b亚型在HVR 1和2的变异性比1a和2a型突出。结论陕西地方株HCV 1b型E1E2区比1a和2a型更易发生突变,1b型E2的HVR变异性更显著。     

郴州地区HCV基因型与病毒载量的相关性分析

目的了解本地区丙型肝炎的流行特征和基因型分布,并分析HCV基因1型与非基因1型病毒载量的关系。方法选择来自郴州地区的60例HCV RNA阳性的初治丙型肝炎患者,进行HCV RNA病毒载量及HCV基因分型检测,依据基因检测结果分为基因1型和非基因1型两组,并对两组进行病毒载量的比较。计量资料满足正态分布采用t检验,不满足正态采用秩和检验。结果本地区HCV基因型有1b、3b、6a、3a、2a、2a＋3a、5a型。其中,1b型25例,占41．6％,其次为3b、6a型各11例（18．3％）,3a型6例（10％）,2a型4例（6．6％）,2a＋3a型2例（3．3％）,5a型1例（1．7％）;HCV基因1型患者中,HCV RNA载量≤100IU／ml者1例、10^4～10^5IU／ml者4例、10^5～10^6IU／ml者10例、10^6～10^7IU／ml者10例;非基因1型患者中,HCV RNA载量≤10^4IU／ml者1例、10^4～10^5IU／ml者6例、10^5～10^6IU／ml者18例、10^6～10^7IU／ml者8例、HCVRNA载量≥100IU／ml者2例。两组病毒载量进行比较,差异无统计学意义（Z=-0．302,P=0．763．）。结论郴州地区HCV基因型以1b型为主,其次为3b和6a型,同时还存在3a型、2a型、5a型,以及2a／3a混合型。HCV基因1型与非基因1型病毒载量高低无区别。     

乙型肝炎病毒X区核苷酸序列变异的检测

目的：了解乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA X区核苷酸序列的变异情况。方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增24例乙型肝炎患者血清HBV DNA X区产物，并直接测序进行分析。结果：24例患者血清中HBV DNA X区都有程度不等的点突变（2－15），11例同时具有nt1762(A→T),nt1764(G→A）发生变异，8例患者同时在nt1636-nt1741几处位点发生变异。结论：HBV DNA X区核苷酸位于nt1762,nt1764双位变异与HBeAg阴性表型有关。     

中国西南地区丙型肝炎病毒6a亚型病毒株的传播速率

目的 探讨HCV 6a病毒株进入中国后在中国西南部地区的播散速率.方法 收集西南医院感染病专科医院2004年1月-2009年9月存留的HCV 6型感染患者血清,采用逆转录巢式PCR方法获取患者血清HCV CE1区序列,绘制系统进化树进行HCV亚型鉴定;用BEAST v1.6.1软件绘制时间系统进化树.结果 本研究获取的HCV 6a病毒株共祖起源于1968年左右,至少存在4个主要的流行株,在静脉吸毒和非静脉吸毒患者人群中均已分离到起源较早的流行株.理论倍增曲线显示,1997年以后HCV 6a病毒传播速率加快,2007年以后加速明显.结论 HCV 6a病毒株在中国西南部地区播散迅速,在未来有可能成为本地区主要的HCV亚型,并有由静脉吸毒人群向非静脉吸毒人群传播的趋势.

Abstract：

Objective To estimate the velocity of HCV subtype 6a transmission in Southwest China. Methods The HCV CE1 region from 61 patients infected with HCV genotype 6 were amplificated by RTPCR and sequenced. The subtypes were identified, and the period of HCV 6a strains originated in southwest china was estimated by using molecular clock phylogenetic analysis. The velocity of HCV subtype 6a transmission in southwest China was estimated by BEAST v 1.6.1 and Tracer vl.5 software theoretically. Reslut Most of HCV 6a strains distributed in Southwest China orgined around the year 1968 and at last 4 epidemic strains existed. The earlier orgined strains could be isolated both in intravenous drug users (IDU) and non-IDU patients. After 1997, the HCV 6a strains transmission in southwest China accelerated and the trend intensified in 2007. Conclusion HCV 6a strains spread fastly both in IDU and non-IDU patients, which might be the main HCV subtype distributed in Southwest China in the future.     

北京地区46例Ⅱ/1b型HCV高变区1的序列变异研究

目的研究北京地区Ⅱ／１ｂ型丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）包膜蛋白Ｅ２／ＮＳ１高变区１（ＨＶＲ１）序列变异规律及意义。方法应用逆转录巢式ＰＣＲ技术从４６例北京地区Ⅱ／１ｂ型ＨＣＶ感染病人血清中扩增了ＨＣＶ部分包膜区基因片断（ｎｔ１１１９～１２５８）,纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果北京地区Ⅱ型ＨＣＶＨＶＲ１位于氨基酸（ａａ）３８４－４０８位,与有关文献报道（３８３－４１０或４１４）略有差异。ＨＶＲ１序列与ＨＣＶ－Ｊ、台湾株、河北株、ＨＢ－１１相应序列比较,核苷酸同源性依次为４４０％～６６．７％（平均５７．７％）,４８．０％～７２．０％（６０．０％）,６０．０％～８５．３％（６９．８％）和５６．０％～８１．３％（６８．２％）,氨基酸同源性依次为２０．０％－５６．０％（３８．２％）,３２．０％～６４．０％（４５．７％）,３６．０％～７６．０％（４９．８％）和４０．０％～７６．０％（５５．６％）。本组ＨＶＲＩ内发现６个较保守的氨基酸位点：３８５位Ｔｈｒ,３８９,３９０,４０６位Ｇｌｙ,４０１位Ｓｅｒ,４０３位Ｐｈｅ。结论对ＨＶＲ１序列变异规律及生物学意义的进一步研究有助于ＨＣＶ疫苗的发展。     

贵州地区HCV感染者基因型分布特征

目的 探讨贵州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布特征,为HCV感染的防控和个体化治疗提供临床依据。方法 选取2011年9月-2018年10月贵阳市公共卫生救治中心1211例HCV RNA阳性的丙型肝炎患者,采用PCR直接测序法,与GenBank中已知的HCV序列进行对比,获得HCV基因型及亚型,并分析其分布与性别、年龄、民族、地区、感染途径等因素的关系。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。结果 1211例HCV感染者共检出4种基因型和11种基因亚型,其中以1b型(26.84%)、3b型(27.17%)和6a型(24.28%)为主。不同HCV基因型在男女感染者中分布差异有统计学意义(χ2=15.428,P=0.009),其中男性以3b型为主(29.34%),女性以1b型为主(32.21%)。不同HCV基因型分布在各年龄组中差异有统计学意义(χ2=67.439,P<0.001),≤18岁组与≥60岁组以1b型为主(分别为66.67%、58.93%),而19~39岁组以3b型(28.93%)、6型(29.29%)为主,40~59岁组以1b型(29.54%)、3b型(27.33%)和6型(24.28%)为主。各种感染途径的HCV基因型分布差异有统计学意义(χ2=153.916,P<0.001),感染方式以静脉药瘾为主(57.97%),其次是性接触和有创美容(均为8.42%);经静脉药瘾、有创美容感染HCV者均以3b型为主(分别为31.48%、32.35%),性接触感染者多为HCV 6型(36.27%)。不同民族、贵州地区间HCV基因型分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论 贵州地区HCV基因型分布呈多样性,3b、1b、6a型为主要流行株,存在HCV 6型中的多种少见基因亚型,且在不同的年龄、性别、感染途径方面HCV基因型分布存在差异。     

A case of genotype‐3b hepatitis C virus in which the whole genome was successfully analyzed using third‐generation nanopore sequencing

A 42‐year‐old Chinese man with chronic hepatitis C virus (HCV) infection visited our hospital for antiviral therapy. The subgenotype could not be determined using the HCV GENOTYPE Primer Kit (Institute of Immunology, Tokyo, Japan), which can identify genotype 3a HCV exclusively among genotype 3 HCV. Thus, the whole‐genome sequence of HCV was analyzed using the MinION nanopore sequencer (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK), a third‐generation single‐molecule sequencing platform. Consequently, a total of 9442 bases with a 73.6 mean depth, corresponding to the sequences between nt25 and PolyU/UC were determined (LC414155.2). The similarity analysis revealed that the obtained sequence was classified into genotype 3b HCV and showed nucleotide identities from 87.6% to 93.9% with those of 12 previously reported strains. Furthermore, possible resistance‐associated substitutions in non‐structural protein (NS)3, NS5A, and NS5B based on consensus sequences of 12 genotype 3b HCV strains, including NS5A‐Y93H and NS5B‐S282 T substitutions, were absent. In conclusion, the MinION nanopore sequencer is useful for analyzing the HCV genome, especially the genomes of genotype 3 HCV strains for which standardized real‐ time PCR methods for all subgenotypes have not been established.     

丙型肝炎病毒感染的检测

丙型肝炎病毒（HCV）感染的检测包括血清学检测和核酸检测（NAT）,前者包括HCV抗体（抗-HCV）、核心抗原检测,后者包括定性/定量RNA检测和基因型/亚型检测。抗-HCV检测是应用最广的HCV感染筛查试验,操作简便、耗时短、成本低,但其缺点是窗口期较长,不能判别是活动性感染还是病毒已被清除,不适用于免疫缺陷人群。HCV RNA是病毒感染的直接证据,既往定性RNA检测灵敏度较高,但随着实时定量PCR技术的成熟,定量检测灵敏度不断提高,线性范围不断拓宽,适用于临床抗病毒治疗应答的监测,也正逐步取代定性检测用于血液制品的筛查。近年HCV抗原检测和抗原抗体联合检测试剂盒已用于HCV感染的筛查及治疗监测,但其灵敏度尚不及NAT。目前主流的HCV基因分型试剂检测基因型有较高的符合率,而检测亚型的结果存在较大差异,需要方法学上的改进。     

Interferon responsiveness in patients infected with hepatitis C virus 1b differs depending on viral subtype

BACKGROUND: Genotype 1b of hepatitis C virus (HCV) comprises mainly three subtypes, each named for its geographic prevalence (worldwide, W; Japan, J; and not in Japan, NJ). AIM: To characterise the newly identified subtypes of genotype 1b and to review factors associated with response to interferon (IFN) for each subtype. PATIENTS: Chronic hepatitis patients (80 men and 41 women; mean age 48.5 years, range 20.7--69.3) with HCV genotype 1b (W type, n=41; J type, n=38) or genotype 2a (n=42) were treated according to the same IFN protocol. Forty four patients (36.4%) negative for serum HCV RNA six months after cessation of treatment were considered complete responders. METHODS: Factors associated with complete response were investigated. RESULTS: Genotype 2a patients had lower viral loads (odds ratio 0.11 (95% confidence intervals (CI) 0.049--0.256)) and a better IFN response (odds ratio 0.25 (95% CI 0.117--0.552)) than genotype 1b patients whereas W type and J type patients had similar viral loads and responses to IFN. IFN response in W type patients was associated with female sex (odds ratio 0.23 (95% CI 0.055--0.983)) and low viral load (odds ratio 84.00 (95% CI 14.04--502.6)) whereas response in J type patients was related to transfusion history (odds ratio 7.20 (95% CI 1.443--35.91)), low viral load (odds ratio 117.0 (95% CI 17.82--768.3)), and genetic mutation in the interferon sensitivity determining region of the virus (odds ratio 0.08 (95% CI 0.013--0.553)). Multivariate analysis found low viral load (odds ratio 64.19 (95% CI 14.66--281.06)) to be the only significant independent factor associated with IFN response. CONCLUSIONS: Factors associated with IFN responsiveness in HCV infection differ with viral subtype.     

慢性HBV/HCV感染人群伴随的免疫相关表现

慢性HBV/HCV感染者常常伴有自身免疫系统紊乱,在丙型肝炎中尤为常见。介绍了慢性丙型肝炎患者免疫状态紊乱的机制,出现非器官特异性自身抗体的比例,以及伴随的免疫相关疾病,如混合型冷球蛋白血症、肾小球肾炎、干燥综合征、甲状腺疾病、2型糖尿病的临床表现、诊断和治疗等。简述了慢性乙型肝炎患者免疫状态紊乱的机制、相关的免疫表现以及抗病毒治疗对其的影响。慢性乙型或丙型肝炎的抗病毒治疗可以减轻伴随的免疫系统疾病,但是不宜采用干扰素治疗,因此,乙型肝炎患者应采用核苷和核苷酸类药物治疗,丙型肝炎患者应采用直接抗病毒药物治疗。     

HBV和HCV母婴传播阻断的研究进展

在我国,母婴传播是人群感染HBV或HCV的重要途径之一。对HBV感染产妇所娩新生儿,我国目前采取注射乙型肝炎疫苗联合免疫球蛋白的方法进行预防接种,其中约有10%新生儿阻断失败;而对HCV感染产妇所娩新生儿,尚无可用的阻断方法。主要介绍了HBV和HCV母婴传播的发生途径、机制、影响因素以及具体阻断措施的最新进展,指出随着对肝炎病毒的进一步探索和发现,实现肝炎病毒母婴阻断将成为可能。     

IL-28B基因多态性与丙型肝炎关系的研究进展

白细胞介素(interleukin,IL)-28B即干扰素λ3,是一类属于干扰素λ家族的新型IL,编码基因位于19号染色体上.IL-28B基因的单核苷酸多态性与基因1型HCV感染者自发清除以及聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合治疗抗病毒应答率之间的关系已有大量研究报道.然而,随着直接抗病毒药物的应用,IL-28B基因型对于三联疗法应答率的预测作用有待进一步研究.此外,IL-28B对基因2、3型HCV感染者抗病毒治疗应答率的影响尚不确定,对肝纤维化进展的影响也存在争议.本文就以上几方面的最新进展进行综述.     

Exploring the hepatitis C virus genome using single molecule realtime sequencing

Single molecular real-time(SMRT) sequencing, also called third-generation sequencing, is a novel sequencing technique capable of generating extremely long contiguous sequence reads. While conventional short-read sequencing cannot evaluate the linkage of nucleotide substitutions distant from one another, SMRT sequencing can directly demonstrate linkage of nucleotide changes over a span of more than 20 kbp, and thus can be applied to directly examine the haplotypes of viruses or bacteria whose genome structures are changing in real time. In addition, an error correction method(circular consensus sequencing) has been established and repeated sequencing of a single-molecule DNA template can result in extremely high accuracy. The advantages of long read sequencing enable accurate determination of the haplotypes of individual viral clones. SMRT sequencing has been applied in various studies of viral genomes including determination of the full-length contiguous genome sequence of hepatitis C virus(HCV), targeted deep sequencing of the HCV NS5 A gene, and assessment of heterogeneity among viral populations. Recently, the emergence of multi-drug resistant HCV viruses has become a significant clinical issue and has been also demonstrated using SMRT sequencing. In this review, we introduce the novel third-generation PacBio RSII/Sequel systems, compare them with conventional next-generation sequencers, and summarize previous studies in which SMRT sequencing technology has been applied for HCV genome analysis. We also refer to another long-read sequencing platform, nanopore sequencing technology, and discuss the advantages, limitations and future perspectives in using these thirdgeneration sequencers for HCV genome analysis.