TrkA与snapin蛋白的直接相互作用

目的确认TrkA与snapin蛋白间的直接相互作用。方法采用DNA重组技术,构建增强型荧光蛋白表达载体pECFP-TrkAICD(TrkA膜内区)和pEYFP-snapin,共转染HEK 293T细胞后以激光扫描共聚焦显微镜观察并进行荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)分析。结果成功构建了snapin和TrkA的重组质粒,共转染细胞后激光扫描共聚焦显微镜分析表明两种蛋白分布在细胞质同一层面,荧光共振能量转移(FRET)分析表明能量转移效率>5%,与对照相比有显著区别(P<0.05)。结论激光扫描共聚焦及FRET实验结果都证明了TrkA膜内区与snapin两个蛋白之间存在着直接的相互作用。     

利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用

目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein,HT036)和P311间的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用.结果 构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达.结论 成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用.     

尿激酶型纤溶酶原激活物生物传感器的构建及鉴定

目的:构建含有增强型青色荧光蛋白-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)融合蛋白的真核表达载体(ECFP-uPA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器。方法:以Src-biosensor为模板,Primer Premier 5.0软件设计YPet引物,设计时5'端引入uPA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以pMD^TM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表达载体。然后转染293T细胞,24 h后观察转染效率和融合蛋白表达情况,在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件观察并测量uPA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与uPA substrate分子大小相符。细胞转染后转染效率达40%。免疫荧光检测,uPA生物传感器在293T细胞膜表达,用重组人uPA(rhuPA)刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结论:成功构建uPA生物传感器,该生物传感器能够作为活细胞分子探针用于研究uPA的时空变化。     

基于FRET技术MMP3生物传感器载体的构建和鉴定

目的: 探讨基质金属蛋白酶3(MMP3)生物传感器载体的构建,阐明MMP3在活细胞中表达的时空信息。方法: 构建定位于细胞膜表面的ECFP-MMP3-YPet生物传感器载体并进行鉴定;转染293T细胞24h后观察转染效率;加尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)刺激293T细胞,运用荧光共振能量转移(FRET)技术在共聚焦显微镜下观察MMP3生物传感器载体的荧光共振能量转移情况ECFP-MMP3-YPet biosensor。结果: 成功构建ECFP-MMP3-YPet biosensor;PCR和双酶切鉴定,MMP3-YPet约780bp,转染293T细胞后MMP3生物传感器在胞质较均匀分布,转染效率约40%。uPA刺激293T细胞后,胞质和胞核内FRET比值逐渐降低,约30min时达到最小值,随后恢复正常。结论: 基于FRET构建的MMP3生物传感器可以敏感而准确地监测活细胞中MMP3的表达情况。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

用FRET技术研究TLR4和MD-2的相互作用

目的 利用荧光共振能量转移（FRET）技术在活体细胞研究人Toll样受体（TLR）4与髓样细胞分化蛋白2（MD-2）的相互作用。方法 用PCR方法扩增TLR4编码序列和MD-2编码序列（不包括信号肽序列）并分别亚克隆入带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白和增强型黄色荧光蛋白表达载体（pECFP-C1-SP，pEYFP-C1-SP）中，重组质粒经酶切、序列鉴定分析后分别或共同转染HEK293细胞．用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和分布情况，并用常规的方法和受体光漂白的方法对共表达青色荧光蛋白（CFP）-TLR4和黄色荧光蛋白（YFP）-MD-2的细胞进行FRET分析。结果 重组质粒在HEK293细胞中得到表达．仅转染pECFP／TLR4或pEYFP／MD-2的细胞可见青色或黄色荧光主要分布在胞质内，以核周较多：而共转染pECFP／TLR4和pEYFP／MD-2的细胞可同时检测到青色和黄色荧光，主要分布在细胞膜，同时胞质也有少量表达。无论是用常规的方法还是受体光漂白的方法，对共表达CFP-TLR4和YFP-MD-2的细胞进行FRET分析结果表明有FRET现象的发生．提示TLR4和MD-2有相互作用并形成复合物。结论 本研究为TLR4和MD-2在活体细胞中的相互作用提供了直接的证据。     

多功能G3BP应激蛋白的红色及蓝色荧光标记

目的:分别构建含有樱桃红荧光蛋白和蓝色荧光蛋白(BFP)标签的应激蛋白G3BP表达质粒,实现活细胞内G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,分别利用EcoRI和BamHI双酶切法将目的片段连接到pmCheery-C1和pEBFP-N1载体上,再将构建成功的pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦显微镜及Western印迹法检测红/蓝色荧光蛋白与目的蛋白G3BP的融合表达以及在活细胞内的共定位情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到红/蓝色融合蛋白的表达,共定位分析结果显示两者均可在HeLa细胞胞浆中形成应激颗粒。结论:pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP构建成功,对G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记有助于进行其在细胞应激方面的机制研究。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体，为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法 采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体，用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞，观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果 DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确；酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确，TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论 所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的，pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上，可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

pLC3-EGFP真核表达载体的构建与表达

目的 构建人微管相关蛋白轻链3(LC3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的真核表达载体(pLC3-EGFP)并在哺乳动物细胞中表达,为研究自噬的过程及机制提供实验基础.方法 应用RT-PCR从人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增全长LC3基因,将产物LC3 cDNA片段亚克隆入载体pEGFP-N3,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒pLC3 -EGFP转染HEK293T细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,westem blot检测LC3-EGFP蛋白的表达.结果 测序结果表明,从人胚肾HEK293T细胞中所获得的LC3 cDNAs含有378个碱基,与Genbank( NM 022818)序列完全一致.构建的重组真核表达载体pLC3-EGFP经鉴定证实LC3基因已完全正确亚克隆到pEGFP--N3;LC3-EGFP融合蛋白能够在HEK293T细胞中表达,并主要定位于细胞质中.结论 成功构建具有报告基因-增强绿色荧光蛋白基因的重组真核表达载体pLC3-EGFP并在HEK293T细胞中很好地表达,实验结果为研究细胞自噬的进程及机制提供了实验基础.     

人GFP—AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWPI(associated with protein kinase Crelated kinase I，AWPI)表达载体,观察AWPI在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT—PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWPI cDNA编码区．并将其重组于GFP表达载体pEGFP—C2中。经酶切，序列鉴定分析后，将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察AWPI在细胞内的表达和分布。结果 GFP—AWPI融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功，并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下，在不携带外源基因的空载体pEGFP—C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中；在重组质粒pEGFP—C2／AWPI转染的293细胞，绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP—AWPI融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

目的：获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES -hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组Ad- Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。     

遗传性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建和在HEK293细胞中的表达

目的构建HERG基因的真核表达载体,并在人胚胎肾细胞（HEK293）中进行表达。方法先将pGH19-HERG通过限制性酶SacⅠ和EcoR Ⅰ酶切得到HERG cDNA,将pIRES2-EGFP用SacⅠ和EcoRⅠ进行双酶切,把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中,即构建了HERG基因的真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG。然后利用电穿孔法将pIRES2-EGFP-HERG转染HEK293细胞。结果在卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG基础上,获得了真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG,并在HEK293细胞中成功进行了表达。结论在HERG基因卵母细胞异源表达载体的基础上,构建了HERG基因的真核表达载体piRES2-EGFP-HERG,利用电穿孔法将其转染至HEK293细胞中并成功地进行了表达,为下一步进行膜片钳的研究奠定基础。     

携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法：利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达。结果：PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论：成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。