靶向Skp2基因siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:设计和构建Skp2特异性的siRNA真核表达载体,观察Skp2siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法:人工合成Skp2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo,通过测序鉴定.用脂质体介导的基因转染方法转入HCT116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达.流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:测序表明Skp2干扰序列完全正确.RTPCR结果显示2条Skp2siRNA真核表达质粒均能有效抑制核干细胞因子mRNA的转录表达( P<0.05).MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降(29.21%±1.40%,30.10%±1.50% vs49.05%±4.50%,53.03%±4.92%,均P<0.05).流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低.结论:成功构建了S k p 2 干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞Skp2mRNA表达,细胞增殖能力减弱,为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.     

靶向survivin基因siRNA在食管癌细胞增殖和凋亡中作用的研究

目的 研究survivin基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株体外增殖能力和凋亡的影响. 方法 构建靶向survivin的小干扰RNA(siRNA)表达载体,用脂质体法转染Eca-109细胞后,采用半定量RT-PCR、Western Blot检测转染前后survivin mRNA及蛋白表达水平的改变,采用噻唑兰(MTT)法检测细胞的生长增殖情况,采用流式细胞术测定细胞的凋亡情况. 结果 靶向survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制Eca-109细胞survivin基因的表达.转染靶向survivin的siRNA表达质粒可以显著抑制Eca-109细胞的增殖(细胞接种24 h、48 h后增殖抑制率分别为21.05%和33.96%),诱导明显的细胞凋亡[转染24 h、48 h后的凋亡率分别为(8.03±1.05)%和(6.22±1.06)%]. 结论 survivin基因特异性RNA干扰可以显著抑制食管癌Eca-109细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡.     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的影响。方法采用真核细胞转染技术将pSi-lencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒转染人结肠癌HCT116细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR、Western blot及免疫组化法分别观察STAT3基因和蛋白的变化,流式细胞仪及AO/EB染色观察细胞凋亡。结果 pSilencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒对大肠癌细胞的增殖有明显抑制作用,与空白组及阴性组相比差异有统计学意义(P0.05);在重组质粒组,STAT3基因mRNA及蛋白的表达与空白组及阴性组相比明显减低(P0.05);重组质粒可诱导HCT116细胞凋亡,细胞周期分期示细胞阻滞于G2期。结论 pSilencer3.0-H1-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3基因在人大肠癌细胞中的表达。     

靶向cyclinE小干扰RNA对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的:以cyclinE基因编码区为靶位,构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,观察转染后对HepG2细胞的影响.方法:针对cyclinE基因序列构建表达siRNA的真核表达载体pSilencer3.1-H1hygro,利用脂质体Metafectene转染CyclinE基因高表达的肝癌细胞株HepG2.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,MTT法检测细胞增殖活性,RT-PCR和Western blot法观察转染后细胞cyclinE基因表达.结果:成功构建了表达siRNA的真核质粒载体,转染后cyclinE基因mRNA及蛋白表达水平分别下降了79%和65%.结论:靶向cyclinE基因的siRNA可有效沉默HepG2细胞高表达的cyclinE基因,从而抑制肝癌细胞的增殖并促进凋亡.     

MUC5AC特异性siRNA对胆管癌细胞株HCCC-9810增殖及凋亡的影响

目的:探讨黏蛋白5AC特异性siRNA对人肝内胆管癌细胞珠HCCC-9810体外增殖及凋亡能力的影响.方法:设计合成三对特异性siRNA, 构建了三个可在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒, pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/应用脂质体转染技术分别将三个稳定表达的质粒和对照质粒( 空质粒对照) 转染HCCC-9810, 应用有荧光标记的非特异性小分子的siRNA检测转染效率, RT-PCR检测黏蛋白5AC基因mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测黏蛋白5AC的表达;MTT检测细胞生长增殖情况;流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:基因测序表明成功构建质粒;转染后荧光蛋白表达率28.57%;RT-PCR结果表明在mRNA水平, 三个质粒都可抑制黏蛋白5AC基因的表达, 并可使黏蛋白5AC的表达下降,MTT结果对细胞的生长有一定的抑制作用,流式细胞仪分析结果使肿瘤细胞凋亡增加.结论:构建pRNAT-U6.1/Neo-MUC5ACsiRNA1/2/3质粒明显抑制了黏蛋白5AC基因在mRNA水平及蛋白的表达, 并可抑制肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡.     

RNAi技术对A549细胞survivin基因表达及顺铂敏感性的影响

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术沉默抗凋亡基因survivin,观察其对人肺腺癌细胞A549增殖以及顺铂药物敏感性的影响.方法 将靶向survivin的基因片段插入到载体后构建重组质粒,将其导入A549细胞,RT-PCR及免疫荧光法分析转染前后A549细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测转染后A549细胞对顺铂的敏感性变化.结果 成功构建pGenesil1.1-survivin重组质粒.转染重组质粒后,A549细胞survivin mRNA和蛋白的表达明显降低;转染前顺铂对A549细胞的IC50明显高于转染后(P＜0.05).结论 靶向survivin的RNAi表达载体能下调survivin基因表达,增强顺铂对A549细胞的药物敏感性.     

TRAIL对耐药相关基因SIRT1的作用

目的 观察肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)在食管癌细胞中的表达及产生的凋亡作用.方法 构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-TRAIL利用脂质体瞬时转染人食管癌细胞EC9706,并设立转染空载体组和未转染组作为阴性对照;48 h后用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别检测其在食管癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达;流式细胞技术检测转染重组质粒24、48 h后对食管癌细胞产生的凋亡效应;用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测SIRT1 mRNA和蛋白表达水平.结果 重组真核表达载体peDNA3.1(+)-TRAIL中TRAIL基因能大量表达且对食管癌EC9706细胞产生凋亡效应,并能显著抑制耐药基因SIRT1的mRNA和蛋白水平的表达.结论 TRAIL可抑制食管癌细胞中SIRT1基因表达.     

VEGFR-3 siRNA体外对人结肠癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)在肿瘤细胞生长中的作用.方法:根据人ⅦGFR-3mRNA编码序列,设计3个RNA干涉靶点,构建siRNA表达载体,并转染到LoVo细胞中,应用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGFR-3mRNA表达水平的变化,采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTT)观察细胞生长变化,并应用流式细胞计数仪分析细胞凋亡的情况.结果:针对,VEGFR-3基因的siRNA表达载体成功构建,psiRNA-VEGFR-3可显著抑制LoVo细胞中VEGFR-3基因的表达,转染psiRNA-VEGFR-3细胞生长明显抑制,并可诱导LoVo细胞出现凋亡.结论:p3iRNA-VEGFR-3载体能够在loVo细胞中引发RNA干扰效应,下调VEGFR-3基因的表达可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.     

Survivin-siRNA真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌DU145细胞的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA,并检测其对DU145细胞株内源性survivin基因和蛋白表达的影响.方法 构建重组质粒shRNA-sur1和-sur2并分别转染 DU145细胞株,通过半定量 RT-PCR和Western印迹检测survivin mRNA转录水平和蛋白表达的变化.结果 成功构建针对survivin干扰的两种真核表达质粒;两种重组质粒shRNA-sur1和-sur2均能明显抑制内源性survivin基因表达,其抑制率分别为72%±8%和77%±5%;两种质粒均能明显抑制survivin蛋白的表达,其抑制率分别为75%±8%和80%±6%.结论 重组质粒shRNA-sur1和-sur2均可明显抑制DU145细胞内源survivin 蛋白表达和mRNA转录,为survivin介导的肿瘤基因沉默提供良好的基础.     

错配修复基因MLH1激活p53和线粒体凋亡通路参与雌激素诱导的结肠癌细胞凋亡

临床和流行病学研究显示雌激素替代治疗可降低绝经后妇女的结直肠癌发生风险。前期研究发现雌激素能上调结肠癌细胞的错配修复(MMR)基因MLH1表达,在MLH1基因缺失的结肠癌细胞中再表达MLH1能明显增强雌激素诱导的细胞凋亡。目的:探讨MLH1参与雌激素诱导结肠癌细胞凋亡所涉及的信号通路以及p53及其相关基因在此凋亡通路中的作用。方法:以含人野生型MLH1(hMLH1)全长cDNA的质粒转染MLH1基因缺失的人结肠癌细胞株HCT116。以转染空质粒的HCT1 16细胞作为对照,在有或无雌激素作用的条件下,采用电泳法检测凋亡DNA Ladder,蛋白质印迹法检测p53等凋亡相关蛋白表达。结果:转染hMLH1后,10~(-8)mol/L雌二醇(E_2)能明显诱导HCT116细胞凋亡。转染hMLH1并经E_2处理的HCT116细胞(D组)与经E_2处理但未转染hMLH1的HCT116细胞(B组)相比,其caspase-3、caspase-9、p53、Bax、胞质细胞色素C蛋白表达均显著增强,D组上述蛋白表达亦均高于转染hMLH1但未经E_2处理的HCT116细胞(C组)。结论:MMR基因MLH1主要通过激活p53和线粒体凋亡通路参与雌激素诱导的人结肠癌细胞株HCT116凋亡。     

survivin基因表达对肺鳞状细胞癌细胞侵袭的影响

目的探讨survivin基因对肺鳞状细胞癌细胞侵袭能力的影响及作用机制。方法应用survivin基因小干扰RNA（siRNA）转染处理人肺鳞状细胞癌细胞后,用荧光实时定量PCR和Western blot检测survivin mRNA和survivin蛋白表达,用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,用琼脂糖凝胶电泳和细胞凋亡原位检测试剂盒检测癌细胞失巢凋亡情况。结果转染组癌细胞survivin mRNA和survivin蛋白表达明显受抑制,且与时间和浓度相关。与对照组比较,转染组细胞形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少,细胞出现明显凋亡现象,并出现明显DNA条带。结论survivin基因siRNA转染可明显抑制肺鳞状细胞癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关。     

RNA干扰p21对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默p21基因对肝癌细胞SMMC-7721增殖及恶性表型变化的影响.方法:通过慢病毒载体将p21小干扰RNA片段稳定转染入SMMC-7721细胞,通过RT-PCR,Western blot分别检MJp21 Mrna和蛋白表达变化,流式细胞仪检测7721-p2l RNAi组(感染p21 siRNA...     

人端粒酶逆转录酶RNA干扰对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）RNA干扰对结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响。方法将HCT116细胞分为转染组（转染重组质粒真核表达载体）、对照组（转染空载体质粒）和未转染组。PCR方法检测hTERT干扰序列,RT—PCR方法检测hTERT表达,HE染色、生长曲线和流式细胞术方法分别检测细胞形态、细胞增殖和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色方法检测细胞衰老,Annexin V／PI染色流式细胞光度术检测细胞凋亡。结果转染细胞内均存在hTERT干扰序列,hTERT干扰率为21．5％;与未转染细胞相比,转染细胞核质比明显缩小,增殖率显著下降（P〈0．05）,衰老细胞和G2-M期细胞明显增加（P〈0．05）。hTERT干扰显著增加结肠癌细胞凋亡（P〈0．05）,而对照细胞各指标均无显著变化。结论hTERT干扰显著影响结肠癌细胞的生物学行为。     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系EGHC-9901凋亡的影响

目的建立稳定表达针对AFP基因siRNA质粒的肝癌细胞模型并探讨对其凋亡的影响。方法构建针对AFP基因的siRNAs表达质粒,脂质体法将该质粒转染肝癌细胞系EGHC-9901,G418筛选4~5周后Western blot及RT-PCR检测靶基因抑制效果,细胞分组：实验组（siRNA-afp）,转染AFP-siRNA质粒组;载体对照组,转染空载体组;空白对照组,未做任何处理组。免疫荧光检测细胞在无血清状态下凋亡情况,Western blot及RT-PCR检测Caspase-3、Caspase-8等凋亡相关蛋白表达。结果在体外成功构建针对AFP的siRNA表达质粒并在体外建立稳定表达该质粒肝癌细胞系EGHC-9901,转染后细胞表达AFP近乎完全抑制;免疫荧光表明促进细胞在无血清状态下的实验组凋亡率为32%±4%,对照组凋亡率为17%±3%,差异有统计学意义（P〈0.05）;RT-PCR及Western blot检测凋亡相关蛋白表明实验组Caspase-3表达较对照组高,差异有统计学意义（P〈0.05）,而Caspase-8、Caspase-9、bcl-2表达无显著差异（P〉0.05）。结论在体外成功建立稳定表达针对AFP基因的siRNA肝癌细胞系,抑制AFP表达可能通过上调Caspase-3表达促进其凋亡。     

Down-regulation of survivin expression by small interfering RNA induces pancreatic cancer cell apoptosis and enhances its radiosensitivity

AIM: To investigate the inhibitory effect of small interfering RNA (siRNA) on the expression of survivin in pancreatic cancer cell line PC-2 and the role of siRNA in inducing PC-2 cell apoptosis and enhancing its radiosensitivity. METHODS: A siRNA plasmid expression vector against survivin was constructed and transfected into PC-2 cells with LipofectamineTM 2000. The down regulation of survivin expression was detected by semi-quantitive RT-PCR and immunohistochemical SP method and the role of siRNA in inducing PC-2 cell apoptosis and enhancing its radiosensitivity was detected by flow cytometry. RESULTS: The sequence-specific siRNA efficiently and specifically down-regulated the expression of survivin at both mRNA and protein levels. The expression inhibition ratio was 81.25% at mRNA level detected by semi-quantitive RT-PCR and 74.24% at protein level detected by immunohistochemical method. Forty-eight hours after transfection,apoptosis was induced in 7.03% cells by siRNA and in 14.58% cells by siRNA combined with radiation. CONCLUSION: The siRNA plasmid expression vector against survivin can inhibit the expression of survivin in PC-2 cells efficiently and specifically. Inhibiting the expression of survivin can induce ipoptosis of PC-2 cells and enhance its radiosensitivity significantly. RNAi against survivin is of potential value in gene t(?)erapy of pancreatic cancer.     

MT2-MMP基因沉默对缺氧条件下培养的胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的 利用特异性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1细胞的膜型金属蛋白酶2（MT2-MMP）基因表达,观察其对缺氧条件下培养的细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 采用脂质体转染法将插入MT2-MMP特异性siRNA的真核表达质粒转染至人胰腺癌AsPC-1细胞株（siRNA组）,以转染过表达MT2-MMP质粒（过表达组）或阴性对照质粒（空载体组）的AsPC-1作为对照.实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表达.在缺氧条件（37℃、1％O2、5％ CO2、饱和湿度的三气培养箱）下培养后,应用CCK-8法检测转染细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwells小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功获取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞株和过表达的细胞株.缺氧条件下培养24h后,空载体组、过表达组、siRNA组细胞增殖的吸光度值（A490值）分别为0.68±0.08、0.80 ±0.08、0.52±0.07;细胞凋亡率分别为（6.2±1.5）％、（2.8±1.1）％、（21.4±3.9）％;每个视野（200倍）的穿膜细胞数分别为（115.8 ±23.2）、（256.4±38.6）、（45.8±18.2）个.siRNA组较空载体组的细胞增殖显著被抑制,穿膜细胞数显著减少,而细胞凋亡率显著增加（P值均＜0.05）.过表达组较空载体组的细胞增殖显著增强,穿膜细胞数显著增加,而细胞凋亡率显著降低（P值均＜0.05）.结论 MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞在缺氧条件下培养后细胞凋亡增加,增殖被抑制,侵袭力减弱.     

Blocking effects of siRNA on VEGF expression in human colorectal cancer cells

AIM:To investigate the expression of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) and its receptors Fmslike tyrosine kinase 1 (FLT-1) and fetal liver kinase 1 (FLK-1) in colorectal carcinoma (CRC),and the blocking effects of small interfering RNAs (siRNAs) on VEGF expression in human colorectal cancer HCT116 cells.METHODS:Immunohistochemical staining for VEGF,FLT-1 and FLK-1 proteins was performed in 82 cases of CRC and 14 normal colorectal mucosae.A siRNA targeting VEGF was synthesized and transfected into HCT116 cells using lipofectamine 2000.Immunocytochemical staining and Western blotting analyses were performed to detect the expression of VEGF protein.The suppressive effect of the siRNA on cell proliferation was detected using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltertrazolium bromide (MTT) assay.Cellular apoptosis was detected using flow cytometry (FCM).RESULTS:The expression of VEGF,FLT-1 and FLK-1 in tumor tissues was significantly higher than that in normal tissues (P=0.008,P=0.000,P=0.000).The expression of VEGF was positively correlated with both lymph node metastasis and clinical stage (P=0.009 and P=0.025,respectively).Immunocytochemistry showed that the expression of VEGF was weakly positive and Western blotting indicated a significant reduction in VEGF-siRNA cell protein levels.VEGF-siRNA cell growth inhibition was assessed by the MTT assay,and the tumor cell proliferation rate was significantly different at 24,48,and 72 h after transfection.FCM results showed that the VEGF-siRNA group had an apparent aneuploid peak.CONCLUSION:VEGF,FLT-1 and FLK-1 are associated with colorectal carcinogenesis.siRNA silencing of the VEGF gene suppresses proliferation,and induces apoptosis in HCT116 cells.The results suggest that VEGF may be a new gene therapy target for colorectal cancer.     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。