Expression of Antisense Human Telomerase RNA Gene in SMMC-7721Cells

背景与目的 :探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人肝癌细胞端粒酶活性的影响。材料与方法 :构建反义hTR基因逆转录病毒载体 ,脂质体介导转染人肝癌SMMC_7721细胞 ,通过Southernblot、TRAP_PCR、流式细胞术检测hTR表达及端粒酶活性变化。结果 :经G418筛选 ,转染细胞形成稳定克隆 ,反义hTR表达增强 ,细胞生长受到抑制、倍增时间延长 ,出现凋亡。 结论 :反义hTR基因表达明显抑制肝癌细胞的生长 ,降低肿瘤细胞的恶性度和异型性。hTR基因是肝癌基因治疗良好的靶点     

反义端粒酶(hTR)基因对人肝癌细胞系生物学行为的影响

背景与目的:探讨反义端粒酶RNA(hTR)对人肝癌细胞端粒酶活性的影响.材料与方法:构建反义hTR基因逆转录病毒载体,脂质体介导转染人肝癌SMMC-7721细胞,通过Southern blot、TRAP-PCR、流式细胞术检测hTR表达及端粒酶活性变化.结果:经G418筛选,转染细胞形成稳定克隆,反义hTR表达增强,细胞生长受到抑制、倍增时间延长,出现凋亡.结论:反义hTR基因表达明显抑制肝癌细胞的生长,降低肿瘤细胞的恶性度和异型性.hTR基因是肝癌基因治疗良好的靶点.     

反义PKCα对CNE-2Z细胞端粒酶活性的影响

 目的　观察反义PKCα对鼻咽癌CNE 2Z细胞生长及端粒酶活性的影响。方法　脂质体转染反义PKCα ,MTT法检测细胞生长 ,TRAP ELISA法检测细胞端粒酶活性。结果　CNE 2Z细胞端粒酶活性为阳性 ,转染反义PKCα可使细胞生长指数 (P <0 .0 1)及端粒酶活性 (P <0 .0 5 )降低。结论　反义PKCα可以抑制CNE 2Z细胞的生长及端粒酶活性 ,PKCα可能通过调控端粒酶活性影响CNE 2Z细胞的生长。     

hTR基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性和凋亡的影响

目的: 研究人类端粒酶(hTR)基因的反义核酸对K562细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响.方法:采用TRAP法检测K562细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化,以及采用TUNEL法观察反义核酸处理前后细胞凋亡的变化.结果:hTR基因反义核酸能有效抑制K562细胞的端粒酶活性,并且诱导K562细胞发生凋亡.结论:hTR基因反义核酸能显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径.     

抑制端粒酶活性对人肾癌细胞生长的抑制作用

目的 :探讨抗端粒酶在肾细胞癌治疗中的意义。方法 :采用脂质体介导法将pBBS2 12 hTR(反义端粒酶RNA真核表达载体 )导入人肾癌GRC 1细胞系中 ,采用TRAP法测定端粒酶活性 ,通过MTT法检测细胞动力学 ,观察细胞的增殖 ,电镜下观察其对细胞凋亡的影响。结果 :端粒酶反义RNA能显著抑制细胞的端粒酶活性 ,抑制细胞增殖并促进其凋亡。结论 :以端粒酶反义RNA抑制端粒酶活性是治疗肾癌的潜在途径     

端粒酶反义RNA 对人喉癌细胞系Hep-2 生长的影晌

 目的　探讨抗端粒酶在喉癌细胞治疗中的意义。方法　用脂质体介导法将 pBBS2 12 hTR(反义端粒酶RNA真核表达载体 )转染入人喉癌Hep 2细胞系中 ,采用TRAP法测定端粒酶活性 ,细胞动力学检测 ,电镜下观察等方法研究其对Hep 2细胞的端粒酶活性、细胞增殖及细胞凋亡影响。 结果　端粒酶反义RNA能显著抑制细胞的端粒酶活性 ,抑制细胞增殖并促进其凋亡。结论　以端粒酶反义RNA抑制端粒酶活性是治疗喉癌的潜在途径。     

HPV18 E6 E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化和恶性转化细胞端粒长度和端粒酶活性

目的：探讨端粒长度、端粒酶活性以及端粒酶亚单位组分（hTERT、hTR）的表达与食管上皮细胞永生化和恶性转化之间的关系。方法：对HPV18E6E7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化细胞系SHEE和恶性转经细胞系SHEEC,通过Southern blot检测端粒长度（TRF）,TRAP法测定端粒酶活性,RT－PCR研究端粒酶催化亚单位（hTERT)端粒酶RNA成分（hTR）的表达。结果：SHEE细胞和SHEEC细胞的端料平均长度比正常食管上皮细胞的明显缩短,但稳定维持在一定长度范围内。SHEE细胞和SHEEC细胞均具有端料酶活性,并均有hTERT和hTR表达。结论：端粒酶表达活化使端粒维持在一定长度是永生化食管上皮细胞SHEE和恶性转化细胞SHEEC能够稳定分裂增殖的重要因素之一。     

反义hTERT对K562细胞端粒酶活性及细胞增生的影响

目的：观察反义hTERT表达质粒转染K562细胞后是否能够抑制端粒酶活性及K562细胞的增生。方法：质粒的构建与转染；将200bphTERTcDNA片段，反向连接于pLNCX-neo质粒上得到反义hTERT基因表达质粒，在体外转染中通过脂质体法将质粒导入K562细胞中，以G418进行筛选得到阳性克隆；以MTT法和形态学法检测反义hTERT表达质粒对K562细胞增生的抑制作用；以TRAP-PCRELISA法来研究反义hTERT基因对K562细胞的端粒酶活性的抑制作用。结果：转染反义hTERT表达质粒细胞与对照组（空白对照及空质粒组）相比较。生长速率明显变慢。部分细胞出现凋亡等形态学改变。反义hTERT对K562细胞的端粒酶活性具有明显的抑制作用。结论：研究构建的端粒酶反义hTERT基因表达质粒转染到K562细胞中后，能够封闭K562细胞hTERT-mRNA的表达，在抑制端粒酶活性的同时，减慢了K562细胞的生长速度。     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶活性及增殖、凋亡的影响

目的 探讨针对人端粒酶RNA（hTR）及其催化亚基（hTERT）的小干扰RNA（siRNA）对肾癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响。方法 将hTR-siRNA、hTERT-siRNA（100nmol／L）单独或联合转染人肾癌786—0细胞,采用RT-PCR法检测hTR、hTERT mRNA表达,TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果 （1）hTR-siRNA可显著降低786—0细胞hTR mRNA表达（P〈0．01）,hTERT-siRNA可显著降低hTERT mRNA表达（P〈0．01）,但彼此互不影响。（2）二者均能显著抑制端粒酶活性（P〈0．01,P〈0．01）,并增加786—0细胞增殖抑制率及凋亡细胞阳性率（P〈0．01,P〈0．01）。二者联合应用与单独应用差异亦无显著性（P〉0．05）。结论 hTR、hTERT siRNA通过抑制各自基因表达,抑制人肾癌细胞端粒酶活性,进而抑制增殖、促进凋亡。     

RPL6/Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR中的差异表达及其与MDR相关性的初步研究

目的 探讨BPL6／Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901／ADR与胃癌细胞系SGC7901的差异表达,以及与胃癌多药耐药(MDR)的相关性。方法 提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞系总RNA;采用内对照RT-PCR检测RPL6基因和Northem杂交、基因克隆与表达、真核表达载体的构建;以电穿孔法基因转染;以流式细胞仪检测瞬时转染细胞的阿霉素蓄积和潴留。结果 内对照RT-PCR和Northern杂交证实RPL6/Taxreb 107在SGC7901/ADR中高表达。将PCR产物克隆人pUCm-T载体并经测序证实。构建正义和反义真核表达载体(pcDNA3．1)并经酶切鉴定证实后,以电穿孔法将正义真核表达载体转入SGC7901,反义真核表达载体转入SGC7901／ADR。转染48h后检测转染细胞的阿霉素蓄积和潴留,结果提示RPI6／Taxreb107转入细胞后对细胞的耐药性有影响。结论 BPI6／Taxreb107在耐药胃癌细胞中高表达,对胃癌的MDR有影响。     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

人血管生成素-1基因转染对胃癌细胞体内致瘤力及血管生成的影响

目的　研究人血管生成素 1 (Ang1 )基因转染人胃癌细胞系SGC790 1后 ,对肿瘤细胞生物学特性以及对小鼠体内致瘤力和血管生成的影响 ,探讨其在胃癌发生及血管生成中的作用。方法构建重组正、反义Ang1真核表达载体 ,采用脂质体转染法 ,将重组载体转染人胃癌细胞系SGC790 1 ,分别得到正、反义载体稳定转染的细胞株 7Ang1 +和 7Ang1 - ,并以半定量PCR及Westernblot方法鉴定转染效果。以MTT比色试验绘制生长曲线 ;以流式细胞仪检测细胞周期分布。通过裸鼠成瘤实验 ,比较转染前后小鼠体内成瘤能力的差别 ,并检测肿瘤组织微血管密度 (MVD) ,判定血管生成程度。结果　 7Ang1 -组细胞Ang1在蛋白及mRNA水平的表达均下调。体内成瘤实验结果显示 ,空载体对照组、7Ang1 +组和 7Ang1 -组瘤体的平均重量 ( x±s)分别为 6 2 4 .0 0± 77.78,6 5 2 .6 7± 1 32 .0 7和2 93.0 0± 95 .5 4 ,7Ang1 -组的细胞成瘤性显著低于 7Ang1 +组和空载体对照组 (P <0 .0 1 )。空载体对照组、7Ang1 +组和 7Ang1 -组肿瘤组织的MVD( x±s)分别为 8.4 4± 1 .33,8.78± 1 .92和 6 .0 0± 1 .73,7Ang1 -组细胞的血管生成显著减少 (P <0 .0 1 )。结论　Ang1在胃癌形成和发展中可能通过诱生血管起促进作用 ,通过反义技术可部分阻断这种作用。     

miR-138对人胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响

探讨microRNA-138（miR-138）对人胃癌SGC-7901细胞株增殖能力的影响及可能的机制。方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000将miR-138 RNA转染人胃癌SGC-7901细胞株,采用荧光实时定量PCR检测miR-138表达丰度;采用流式细胞术检测转染后的细胞周期;采用MTT法检测细胞生长曲线;采用Western blotting检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达。结果:转染miR-138 RNA后,SGC-7901细胞内miR-138表达丰度升高,细胞增殖能力受到显著抑制,同时hTERT蛋白表达水平下调。结论:miR-138可抑制人SGC-7901细胞的增殖能力,机制可能是通过抑制靶基因hTERT蛋白的表达。      

锌带基因ZNRD1在胃癌耐药细胞中的表达和功能

目的 探讨锌带基因ZNRD1在多药耐药胃癌细胞中的表达和作用。方法 应用Northern blot和半定量RT—PCR,观察锌带基因ZNRD1在胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)诱导的耐药细胞SGC7901／VCR中的表达;将反义核酸转染SGC7901／VCR细胞,通过免疫组化检测转导细胞与非转导细胞ZNRD1蛋白的表达;以流式细胞仪检测细胞周期的变化,以MTT实验检测细胞生长曲线和对VCR、阿霉素(ADM)的药敏性。结果 胃癌耐药细胞SGC7901／VCR与非耐药细胞相比,ZNBDl基因的表达明显增高。转导株antiZNRDl—SGC7901／VCR细胞的ZNRD1蛋白水平明显低于非转导株,C1期细胞比例增加而S期比例减少,生长受到抑制,且对VCR、ADM的敏感性明显增高。结论 胃癌耐药细胞与非耐药细胞相比,ZNRDl基因处于高表达状态。反义核酸转染可有效阻断ZNRDl蛋白的表达,在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药性。     

Delivering antisense telomerase RNA by a hybrid adenovirus/ adeno-associated virus significantly suppresses the malignant phenotype and enhances cell apoptosis of human breast cancer cells

Activated telomerase is frequently detected in cancer cells and is able to maintain and stabilize the integrity of telomeres; it also contributes to unlimited divisions in cancer cells. Recently, a new generation of selective anticancer strategies is under development targeting the blockage of telomerase activity either at the protein level or telomerase RNA. Here, we report suppression of the malignant phenotype by the expression of the full-length antisense human telomerase RNA (hTR) delivered by a novel hybrid vector recombining adenovirus and adeno-associated virus (vAd-AAV). The hybrid vector vAd-AAV retained the unique traits from two parental viruses, such as high efficiency of gene transfer in mammalian cells and the ability to integrate into the genomic DNA of host cells. The stable expression of antisense hTR in MCF-7 cells significantly suppressed telomerase activity and progressively shortened telomere length for 30 population doublings (PD30). Expression of antisense hTR leads to a telomere-based growth arrest and the induction of spontaneous apoptosis. Antisense hTR decreased soft agar colony formation and reduced the cell proliferation, leading to exit from the cell cycle at G1 at PD15. The expression of antisense hTR also sensitized MCF-7 cells to apoptosis induced by sodium butyrate or serum starvation. Our study demonstrates that delivering antisense hTR by the hybrid Ad/AAV vector is an effective antineoplastic gene therapeutic strategy, which significantly suppresses the malignant phenotype and enhances apoptosis of human breast cancer cells.     

增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应

目的观察增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法用ＤＮＡ重组方法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核表达质粒ｐＤＯＲｎｅｏ中，构建成人ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲＰＣＮＡ，用脂质体介导转染人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１。结果经Ｇ４１８筛选获得转染细胞ＳＧＣ／ＰＣＮＡ，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，ＲＮＡ、蛋白质的生物合成受到抑制，Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期ＤＮＡ含量降低。结论ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。