大鼠基质金属蛋白酶抑制因子-1 pRNAT-U6.2 小干扰RNA表达载体的构建

目的:构建大鼠基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)小干扰RNA的真核表达质粒pRNAT-U6.2 siRNA.方法: 依据siRNA设计原则确定以序列447～465 nt、522～540 nt、142～160 nt为TIMP-1 siRNA靶序列, 体外分别合成两端含BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆于pGEM-T载体, T7和SP6为引物进行PCR鉴定;双酶切pGEM-T将其定向克隆到siRNA表达载体pRNAT-U6.2,用pRNAT-U6.2的插入鉴定引物进行PCR鉴定,阳性重组质粒测序.结果:DNA测序证实合成的并被克隆入真核表达载体pRNAT-U6.2的siRNA插入序列与设计完全符合.结论:TIMP-1 siRNA表达载体构建成功, 为后期研究TIMP-1 pRNAT-U6.2 siRNA作用、意义及效果奠定了实验基础.     

慢病毒干扰小鼠附睾特异的meClps基因可降低精子的运动能力

目的筛选能有效干扰小鼠附睾特异的类辅脂酶meClps基因表达的RNA靶点,并通过慢病毒介导的RNAi敲低meClps
表达后分析对精子运动的影响。方法构建真核表达载体pDsRed2.0-C1-meClps中并转染NIH-3T3细胞,用meClps抗血清检
测meClps蛋白的表达。针对meClps基因的序列设计并合成3对靶向干扰meClps表达的寡核苷酸序列,构建重组慢病毒载体
pRNAT-U6.2/lenti-RNAi-251、224和286。将重组慢病毒干扰质粒分别与pDsRed2.0-C1-meClps共转染到NIH-3T3细胞,半定
量PCR和Western blotting检测meClps基因在mRNA和蛋白水平的变化。将筛选得到的干扰效果最好的慢病毒载体包装慢病
毒,注射到小鼠附睾头部组织后分析对附睾尾部精子运动性能的影响。结果构建了体外表达meClps 蛋白的
pDsRed2.0-C1-meClps 表达载体和靶向meClps 基因的慢病毒RNAi 载体。靶向meClps 的RNA 干扰载体对转染
pDsRed2.0-C1-meClps后的NIH-3T3 细胞中的meClps 的mRNA和蛋白表达都有抑制,但以转染pRNAT-U6.2/lenti-RNAi-251
对meClps的抑制效果最明显。包装后的慢病毒注射到小鼠附睾头部后附睾尾部组织中的精子运动速率降低（P<0.05）。结论
筛选出RNAi-251能有效干扰meClps表达,通过慢病毒介导的RNAi敲低meClps表达后精子运动性能降低。
     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

同时沉默Livin基因和MTA1基因的siRNA载体的构建

目的:构建同时沉默Livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体.方法:设计Livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-Livin和pRNAT-U6.2-MTA1.AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475 bp的MTA1 siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-Livin重组,得到pRNAT-U6.2-Livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞Livin和MTA1基因mRNA的表达情况.结果:针对Livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确.PCR扩增证实MTA1 siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-Livin.RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-Livin-MTA1的EC9706细胞Livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低.结论:同时沉默Livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功.     

间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的针对间皮素(MSLN)构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装,探讨MSLN功能.方法根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNAT-U6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒,转染OVCAR-3细胞后,检测RNA干扰效率,选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装,并检测病毒滴度,用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNAT-siRNA3的RNA干扰效率最高,为67.5%.鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108ifu/mL.pRNAT-siRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%,pRNAT-siRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为(15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论pRNAT-siR-NA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR-3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个良好的平台.     

NgR特异性siRNA筛选及其慢病毒表达载体构建

目的:筛选出高效的NgR(Nogo受体)特异性siRNA,并构建其慢病毒表达载体。方法:按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,转染体外培养大鼠原代皮层和海马细胞,筛选出基因高沉默效率的NgR特异性siRNA;将获得的高沉默效率siRNA克隆入慢病毒质粒pRNAT—U6.2/Lenti(SD1259),构建NgR特异性siRNA慢病毒表达载体,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果:在4对siRNA中筛选出高沉默效率的NgR特异性siRNA199序列,将该序列的发卡式RNA成功克隆入载体pRNAT-U6.1/Neo,构建成NgR特异性siRNA199表达载体,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论:NgR特异性siRNA199及其慢病毒表达载体构建成功,为进一步观察NgR特异性慢病毒载体RNA干扰抑制大鼠NgR mRNA表达的神经元细胞实验奠定了基础。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干扰慢病毒表达载体。方法 根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM_002500),设计并合成4 对shRNA(NeuroD1~D4),与载体pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD 表达载体,转化入感受态细胞DH5α; real-time PCR 技术检测pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(Packaging Mix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real-time PCR 检测显示以pcDNA^TM 6.2-GW/EmGFP-miR-NeuroD1的沉默效应最佳(P<0.01)。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-NeuroD1-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×108 ifu/mL。结论 成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。     

VEGF基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法 将靶向VEGF基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中,获得pRNAT-shVEGF质粒,经PCR和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pPACKHl通过Lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实,VEGFshRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为3x107pfu/ml.结论 成功构建人VEGF基因RNAi慢病毒载体,为研究其在白血病细胞中的生物学功能和基因治疗奠定基础.     

TNF-α基因siRNA真核表达载体的构建及其对A549细胞TNF-α和TGF-β1表达的影响

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α（TNF-α）基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,观察其对人肺腺癌A549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α（NM₀00594）序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列（siTNF-α）和一对无关序列（siCon）。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染A549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的A549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组（FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05）。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默A549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。     

慢病毒为载体的siRNA抑制肝星状细胞TIMP-1的表达

目的观察以慢病毒为载体,用含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、具有较强抑制作用的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后对TIMP-1表达的抑制作用。方法针对大鼠TIMP-1 mRNA基因序列挑选2个不同短片段(nt161～181和nt445～463),在体外构建为短发夹siRNA1、siRNA2表达载体后,将其包装为重组Lenti/siRNA1-TIMP-1/GFP和Lenti/siRNA2-TIMP-1/GFP,同时包装阴性对照Lenti/GFP(空载体组),并以滴度MOI=10感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6,感染后3d,用流式细胞仪及荧光显微镜检测病毒的感染效率。分别在感染后7、9d用Western blotting方法检测TIMP-1蛋白表达情况。结果感染HSC-T6后细胞形态和增生速度未发生明显变化。流式细胞仪及荧光显微镜检查证实感染效率分别为:空载体组68.23%,siRNA1感染组57.93%,siRNA2感染组51.2%,与正常细胞相比,感染后7d和9d,siRNA1、siRNA2感染组TIMP-1蛋白表达均有所下降,但只有siRNA1感染组在感染后9d能显著抑制TIMP-1表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组Lenti/siRNA-TIMP-1/GFP可短期有效抑制大鼠肝星状细胞系HSC-T6TIMP-1蛋白表达。     

siRNA干预CTGF和TIMP-1对大鼠肝星状细胞胶原分泌的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)和组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1)对肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)CTGF和TIMP-1基因表达以及对Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响。方法根据已筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,将化学合成siRNA CTGF和siRNA TIMP-1以脂质体LipofectamineTM2000介导,瞬时转染HSC-T6细胞,分别设siRNA CTGF组、siRNA TIMP-1组、siRNA CTGF和siRNA TIMP-1联合组、脂质体组及非特异性(negative control,NC)siRNA组,抽提转染24、48h细胞mRNA和蛋白,并收集细胞上清液。应用RT-PCR鉴定CTGF和TIMP-1mRNA的表达;Western blot检测其蛋白表达;ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。结果各干预组转染24、48h后分别与脂质体组和NC siRNA组比较,HSC-T6细胞CTGF及TIMP-1mRNA和蛋白表达均明显下调(均P<0.05),且干预组HSC-T6培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少(均P<0.05)。siRNA联合组分别与siRNA CTGF组和siRNA TIMP-1组比较,于转染48hsiRNA联合组较siRNA TIMP-1组抑制率高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量比siRNA TIMP-1组少,且差异具有统计学意义(均P<0.05);而与siRNA CTGF组比较,其CTGF mR-NA和蛋白抑制率增高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量较siRNA联合组减少,但差异无统计学意义(均P>0.05)。结论针对HSC-T6CTGF mRNA基因全长943位点和TIMP-1mRNA 304位点化学合成的siRNA,对靶基因mRNA和蛋白表达有较好的抑制效果,CTGF和TIMP-1沉默可显著减少细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;CTGF和TIMP-1两种基因同时沉默,有增强抗肝纤维化效果的可能。     

siRNA沉默大鼠Robo2对培养DRGs神经元突起生长的影响

目的:观察沉默Robo2基因后对体外DRGs神经元突起生长的影响。方法:构建大鼠pSI H1-H1-copGFP-Robo2si RNA表达质粒,使用慢病毒(lentivirus)包装系统,在293T细胞中包装含Robo2si RNA的慢病毒颗粒,然后转染DRGs神经元。实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-FQPCR),Westernblot检测Robo2mRNA和蛋白的表达,显微镜下观察DRGs神经元突起生长情况。结果:RT-FQPCR检测DRGs神经元中Robo2mRNA的表达量,Robo组明显低于正常组,具有显著性差异(P<0.01)。Western blot检测DRGs神经元中Robo2蛋白的表达量,Robo组明显低于正常组,具有显著性差异(P<0.01)。Robo2si RNA转入DRGs神经元的转导率为93.01%,与正常组比较,Robo2si RNA-lenti-virus转导细胞(Robo)组轴突生长明显受到抑制。结论:Robo2蛋白是DRGs神经元轴突生长的重要导向分子,可促进轴突的生长。     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

稳定表达PLCγ1 siRNA慢病毒的构建及对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的 制备在人大肠癌系LoVo中稳定抑制磷脂酶C(PLC)γ1的重组慢病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用.方法 制备产生PLCγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系.应用Westem-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析.应用流式细胞仪分析PLCγ1 siRNA对细胞凋亡的影响.结果和结论 PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,显著增加了5-FU诱导的凋亡.     

两种不同病毒载体携带靶向大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)－1小干扰RNA抗肝纤维化作用的比较

目的观察以腺相关病毒(AAV)及慢病毒(Lentivirus)为载体含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型的干预作用。方法挑选针对大鼠TIMP-1基因具有较强抑制作用的siRNA序列,在体外构建为短发夹表达载体后,将其包装为重组AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1,同时包装对照病毒AAV/EGFP和Lenti/EGFP。将Wistar大鼠分为对照组、CCl4模型组、AAV/EGFP组、Lenti/EGFP组、AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组,观察CCl4造模4周后,经H&E及Masson染色评价各组动物的肝纤维化状况,经荧光定量RCR及Western blot方法检测TIMP-1的表达抑制情况。结果 H&E及Masson染色证实,与对照组相比,CCl4模型组、AAV/EGFP组、Lenti/EGFP组肝脏胶原纤维明显增加,纤维化评分多为3-4级,同时肝脏TIMP-1的转录与蛋白表达水平均明显上升;而AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组肝纤维化程度明显减轻,纤维化评分多为2-3级,伴随肝脏TIMP-1的转录与蛋白表达水平均显著抑制。AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1组在组织学表现及TIMP-1基因的转录与表达水平上无统计学差异。结论 AAV/siRNA-TIMP-1和Lenti/siRNA-TIMP-1均可有效抑制大鼠肝脏TIMP-1基因表达,进而发挥抗肝纤维化作用。     

慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

 目的  构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法  使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果  PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论  成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。     

RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1,实验组慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。