妊娠期肝内胆汁淤积症患者外周血淋巴细胞凋亡调控基因的初步研究

目的探讨外周血淋巴细胞凋亡调控基因在妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）发病中的意义。方法采用免疫细胞化学染色技术检测ICP患者和正常妊娠妇女外周血淋巴细胞上凋亡调控基因Fas、FasL、Bcl-2的蛋白表达水平;采用RT—PCR法检测外周血淋巴细胞上凋亡调控基因mRNA表达水平。结果ICP患者外周血淋巴细胞上Fas的表达低于正常妊娠者（P〈0．005）,FasL的表达与正常妊娠组差异无统计学意义,Bel-2的表达则高于正常组（P〈0．05）;ICP患者外周血淋巴细胞上Fas mRNA水平低于正常妊娠组（P〈0．001）,FasL mRNA及Bcl-2mRNA水平与正常组差异无统计学意义。结论ICP患者存在外周血淋巴细胞凋亡调控基因表达异常。     

风湿性心脏病患者外周血 CD3+CD4+T 淋巴细胞与 hs-CRP、IL-6表达的变化及意义

目的：探讨风湿性心脏病患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表达与超敏C反应蛋白(hs-CRP)及 IL-6的水平和意义。方法风湿性心脏病患者38例,健康者37例(对照),采用流式细胞术检测风湿性心脏病患者外周血 CD3+ CD4+ T 淋巴细胞表达水平,ELISA 测定 hs-CRP 和 IL-6的水平。结果风湿性心脏病患者外周血 CD3+ CD4+ T 淋巴细胞表达水平明显高于健康者(P <0.05)。风湿性心脏病患者外周血 hs-CRP 及 IL-6水平明显高于健康者(P <0.05)。风湿性心脏病患者外周血 CD3+CD4+ T 淋巴细胞表达水平与外周血 hs-CRP、IL-6呈正相关关系(P <0.01)。结论CD3+ CD4+ T 淋巴细胞表达增高与风湿性心脏病的发病有关;风湿性心脏病患者外周血 CD3+ CD4+ T 淋巴细胞表达增高影响 hs-CRP 及 IL-6,参与风湿性心脏病的发病。     

原发性痛风患者外周血单个核细胞PYCARD基因及其转录剪接体的表达变化

目的 了解凋亡相关斑点样蛋白(PYCARD)基因及其转录剪接体-1、-2(PYCARD-1、-2)在原发性痛风(PG)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达水平及作用.方法 采用半定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测95例PG患者[原发性痛风急性期(APPG)44例、原发性痛风非急性期(NAPPG) 51例]和87例健康对照PBMCs中PYCARD基因及其PYCARD-1、-2 mRNA表达水平;Western blot法检测PG患者和健康对照PBMCs的PYCARD、核因子-κB(p105/p50) [NF-κB(p105/p50)]蛋白表达水平;检测APPG、NAPPG患者与健康对照血尿酸及部分血常规指标,并分析PYCARD基因及其PYCARD-1、-2 mRNA表达与各指标的相关性.结果 APPG与NAPPG患者PYCARD基因及其PYCARD-1、-2 mRNA相对表达量均高于健康对照组(P＜0.01),NAPPG患者PBMCs中PYCARD、2x mRNA和2y mRNA的相对表达量高于健康对照和APPG患者组(P＜0.05);PG患者PYCARD、NF-κB(p105/p50)蛋白表达均高于健康对照组[分别为(4.900±1.324) vs.(3.975±0.210)和(0.263±0.106) vs.(0.127±0.008),P均＜0.05];相关性分析显示NAPPG组PYCARD-2 mRNA表达与嗜中性粒细胞绝对值呈正相关(r=0.378 5,P＜0.01).结论 PG患者PBMCs中PYCARD基因及其转录剪接体mRNA表达以及PYCARD蛋白表达均异常,提示在PG患者的炎症反应中PYCARD基因及其转录剪接体可能发挥重要的调控作用.     

CCL27 CCL28及 CCR10在癫痫小鼠急性期表达增高

目的：探讨趋化因子 CCL27、CCL28及其受体 CCR10在小鼠癫痫急性期外周血中的表达变化。方法取正常及癫痫小鼠急性期不同时间点(10 min、30 min、1 h、2 h)外周血利用实时荧光定量 PCR(Real-time PCR)法检测毛果云香碱致癫痫发作小鼠急性期外周血中 CCL27、CCL28 mRNA 水平;同期取正常及癫痫急性期不同时间点(10 min、30 min、1 h、2 h)肝素抗凝外周血,提取淋巴细胞层后利用 FACSsort 型流式细胞仪检测外周血淋巴细胞 CCR10蛋白水平的表达变化。结果癫痫小鼠发作急性期外周血中 CCL27、CCL28 mRNA 水平、淋巴细胞中 CCR10蛋白表达水平均在癫痫发作2 h 高于对照组(P <0.05)。结论癫痫发作早期已出现外周血免疫功能紊乱,该病理变化可能与癫痫发病过程中的炎性反应和神经细胞的凋亡相关。     

沙鼠短暂脑缺血再灌p53基因表达

目的：研究脑缺血再灌后p53基因表达变化。方法：采用沙鼠短暂前脑缺血再灌损伤模型,应用Northern blot检测脑缺血再灌后不同时期额叶p53 mRNA表达。结果：沙鼠脑缺血6min,在再灌后6h p53 mRNA出现表达增加,持续至第3d（P＜0.05)。结论：沙鼠短暂脑缺血后,促凋亡基因p53存在持续高表达,其结果可能是启动细胞凋亡,导致缺血神经细胞损伤死亡。     

急性特发性血小板减少性紫癜患儿外周血淋巴细胞过氧化物酶体增生物活化受体γmRNA表达及其与血清白细胞介素-2的相关性

目的检测急性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿外周血淋巴细胞过氧化物酶体增生物活化受体γ(PPAR-γ)mRNA表达变化及其与血清白细胞介素-2(IL-2)的相关性。方法急性ITP组为急性ITP患儿53例,对照组为同期体检儿童50例;反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测外周血淋巴细胞PPAR-γmRNA的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中IL-2水平。结果急性ITP组患儿外周血淋巴细胞PPAR-γmRNA表达显著高于对照组(P<0.05),血清中IL-2的含量显著低于对照组(P<0.05);急性ITP患儿血清中的IL-2含量与外周血淋巴细胞PPAR-γmRNA表达呈负相关(r=0.81,P<0.05)。结论急性ITP患儿外周血淋巴细胞PPAR-γmRNA的表达可能抑制了IL-2的生成,PPAR-γ与IL-2可能参与了急性ITP的发病过程。     

早期高容量血液滤过后多器官功能障碍综合征猪血清IL-6浓度及肺IL-6 mRNA表达的变化及意义

目的:探讨早期高容量血液滤过(HVHF)后多器官功能障碍综合征(MODS)猪血清IL-6浓度及肺组织IL-6 mRNA表达水平的变化及意义.方法:雄性家猪25只随机分为模型组(n=9)、滤过组(n=10)、对照组(n=6).对照组输注生理盐水,模型组和滤过组采用二次打击建立MODS模型,而后滤过组采用HVHF治疗3 d.双夹心ELISA法测定血清IL-6,实时荧光定量RT-PCR技术定量检测肺IL-6 mRNA表达水平.应用Annexin-V/PI双标记流式细胞仪法检测淋巴细胞的凋亡.结果:滤过组滤过后各脏器功能有关指标水平、器官衰竭发生率、动物死亡率较模型组明显降低且有显著差异(P＜0.05);滤过组血清IL-6浓度及肺组织IL-6 mRNA表达水平较之模型组明显降低并相差显著(P＜0.05);滤过组淋巴细胞凋亡率较之模型组降低并相差非常显著(P＜0.01).结论:早期应用HVHF可以降低创伤引起的血清IL-6及肺组织IL-6 mRNA表达升高,并使淋巴细胞凋亡率下降,降低肺衰竭发生率.     

p21、p53基因表达及其单核苷酸多态性与肝细胞肝癌的关系

目的探讨肝细胞肝癌患者p21和p53基因的表达及其单核苷酸的多态性，分析其与肝细胞肝癌的关系。方法选择50例肝细胞肝癌患者和50名健康志愿者，采用PCR技术检测两组外周血白细胞中的p21和p53基因的表达情况，采用PCR—RFLP方法检测p213’UTR位点以及p53intron6位点的基因多态性。结果肝癌组p21和p53mRNA表达显著高于对照组（P〈0．01）。饮酒能够增加p53mRNA的表达。p21基因3’UTRC／T位点C／T＋T／T型与60岁以上人群肝癌患病率升高有关。结论p21基因以及p53基因的高表达可能与肝细胞肝癌有一定的相关性，饮酒能够使肝癌患者1353基因的表达升高。     

早幼粒白血病在银屑病病人外周血淋巴细胞中的表达及其与p53和bcl-2家族的相关性

目的研究早幼粒白血病(promyelocytic leukaemia,PML)、p53、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bcl-2 associated X protein,bax)在银屑病外周血淋巴细胞中的表达,并评估上述因子之间的相关性。方法分离25例银屑病病人和20例健康对照的外周血淋巴细胞,通过qRT-PCR和流式细胞学分别检测PML、p53、bcl-2和bax在外周学淋巴细胞中mRNA和蛋白的表达水平。采用Pearson相关性分析评估PML与上述因子之间的相关性。结果与健康对照相比,银屑病病人外周血淋巴细胞中PML和p53的mRNA及蛋白表达增加,bcl-2的mRNA及蛋白表达下降,bax的mRNA表达下降但蛋白表达增加。PML蛋白表达与p53、bcl-2以及bax蛋白表达呈相关性。结论 PML可能参与了银屑病发病过程。     

大鼠脊髓急性损伤后凋亡相关基因的表达

目的：检测大鼠脊髓损伤后凋亡相关基因的表达,以探讨神经细胞凋亡的分子机制。方法：大鼠脊髓T8-9经中度压迫损伤后,分别在30min,2、4、8、24、48和72h处死取材（n=6）,应用免疫组化及原位杂交技术对脊髓组织进行标记,以检测p53,bcl-2,bax的表达。结果：损伤4h后P53,Bax蛋白及p53mRNA大量表达,其中P53蛋白在24h达到高峰,而Bcl-2仅有少量表达,bcl-2mRNA未见表达。结论：脊髓损伤后凋亡基因（p53,bax)大量表达,并可能在神经细胞的凋亡过程中起重要作用。     

川崎病患者外周血淋巴细胞凋亡降低及其机理的研究

为探讨外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）凋亡在川病（ＫＤ）发病中的作用。以正常儿童ＰＢＭＣ为对照,观察ＫＤ患者ＰＢＭＣ体外经ａｎｔｉ－ＣＤ３刺激培养后的凋亡细胞百分率和片断ＤＮＡ分析;测定ＰＢＭＣ体外ＰＨＡ导培养产生ＩＬ－６水平,并利用流式细胞你和斑点杂交检测外周血淋巴细胞Ｐ＾５３基因表达水平。与正常对照比较,ＫＤ患者ＰＤＭＣ体外培养产生ＩＬ－６水平明显增高,凋亡细胞百分率降低,片断ＤＮＡ出现时间延迟,     

人乳腺癌MCF-7细胞凋亡过程中p53与bcl-2表达的时序性

研究细胞凋亡过程中p53与bcl－2基因表达变化的时序关系,以探索p53调控bcl－2的可能性。方法：选择具有野生型p53的人乳腺癌MCF-7细胞系,用5－Fu为诱导剂诱导细胞凋亡;用Northern杂交及Western印迹法检测细胞凋亡过程中p53与bcl－2表达变化的时序性。结果：p53表达增高出现在bcl－2表达降低之前。结论：p53在时序上具有作为bcl－2基因负调控转录因子的可能性。     

p53 in fibroblast-like synoviocytes can regulate T helper cell functions in patients with active rheumatoid arthritis

Background  p53 is a tumor suppressor and plays a key role in regulating cell hyperplasia, repairing DNA and inducing apoptosis. This study was to investigate p53 expression in fibroblast-like synoviocytes (FLS) and its effect on CD4⁺ T lymphocytes from patients with active rheumatoid arthritis (RA).

Methods  Human FLS were transfected with p53 siRNA and cocultured with CD4⁺ T lymphocytes from patients with active RA. The expressions of osteoprotegerin and interleukin (IL)-6 were detected in p53 siRNA and scramble siRNA-transfected FLS. In addition, protein levels of interferon (IFN)-γ, IL-17, IL-4 and CD25 as well as mRNAs of IFN-γ, retinoic acid-related orphan receptor (ROR)-γt, IL-17 and Foxp3 in cocultured CD4⁺ T lymphocytes were also measured.

Results  IL-6 decreased in p53-knockdown FLS while osteoprotegerin expression was not altered. FLS with p53 deletion significantly increased the production of IL-17 and IFN-γ by CD4⁺ T cells and upregulated Foxp3 mRNA expression without effects on the proportion of CD4⁺CD25^high T lymphocytes.

Conclusion  p53 in FLS might regulate Th1 and Th17 functions in patients with RA and participate in the pathogenesis of RA.

     

IL－2和IL－6基因在急性移植物抗宿主病患者外周血单个核细胞中的表达

目的：研究ＩＬ－２及ＩＬ－６在急性ＧＶＨＤ中的表达状态。方法：采用细胞原位杂交方法，对骨髓移植后发生急性ＧＶＨＤ患者的外周血单个核细胞检测其ＩＬ－２和ＩＬ－６的表达水平，测定积分光密度值。结果：ＩＬ－２表达在急性期与缓解后比较，ｔ＝５．９９，Ｐ＜０．００１，差异非常显著；ＩＬ－６表达在急性期与缓解后比较，ｔ＝３．５９，Ｐ＜０．０１，差异显著。结论：ＩＬ－２和ＩＬ－６在急性ＧＶＨＤ时表达升高，在缓解后降低，其表达状态有助于探讨ＧＶＨＤ的免疫病理损害机理。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖?迁移和凋亡的影响?【方法】 构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株?实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)?CLU-RNAi-LV2(KD2)?CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)?应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化?用细胞划痕实验?MST-1?流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖?迁移?凋亡等生物学行为的改变?【结果】 成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒?Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1?KD2?KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%~96.5%和0?Western blot结果显示KD1?KD2?KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%?46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达?划痕实验显示24 h时 KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43 ± 25.92)小于NC组(101.35 ± 6.05)和CON组(68.13 ± 6.64,P < 0.05)?WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P < 0.05),各组间差异(P < 0.05),均有统计学意义?流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组?CON组细胞凋亡率分别为(6.23 ± 2.51)%?(1.05 ± 0.30)%和(1.17 ± 0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组?CON组相比凋亡率增加(P < 0.05),差异有统计学意义?肾癌786-O细胞的增殖?迁移受到抑制,而凋亡率增加?【结论】 筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株?CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖?迁移并促进细胞凋亡?     

RNA干扰突变型p53基因对胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默人胃癌SGC7901细胞中的突变型p53基因,观察其对细胞生物学行为的影响。方法:p53小干扰RNA(siRNA)重组质粒用脂质体介导法转染SGC7901细胞,另设未转染组和对照组。RT-PCR和Western blot分别检测p53基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况及其对奥沙利铂药物敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡,平板克隆形成试验、裸鼠移植瘤成瘤实验分析细胞成瘤性变化。结果:p53 siRNA可显著下调SGC7901细胞中突变型p53基因mRNA和蛋白的表达,实验组较未转染组和对照组细胞生长曲线左移。实验组的G0/G1期细胞数较对照组和未转染组分别减少7.4%和6.7%,进入S期的细胞数增加17.2%,奥沙利铂诱导的细胞凋亡率明显降低,未转染组、对照组和实验组细胞的IC50分别为15.88μmol/L、14.32μmol/L和20.34μmol/L。与未转染组和对照组相比,实验组细胞平板克隆形成数量显著增多,裸鼠体内细胞成瘤性增加。结论:p53 siRNA可有效抑制突变型p53基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,但利用RNA干扰技术靶向突变型p53基因在胃癌的治疗上尚存在不确定性。     

逆转录病毒介导的p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的 :观察人类野生型 p5 3(wtp5 3)基因对人食管癌细胞系的抑制作用。　 方法 :用逆转录病毒为载体 ,将外源性wtp5 3基因导入人食管癌细胞系ECA10 9,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及其对肿瘤的抑制作用。　结果 :p5 3在转染细胞ECA10 9/p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使ECA10 9细胞的生长速度减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低 ,调亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。　结论 :逆转录病毒载体介导的外源性wtp5 3基因能够抑制人食管癌细胞生长     

α-细辛醚、β-细辛醚改善Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤及机制

目的：探究α-细辛醚、β-细辛醚对β淀粉样蛋白活性片段Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用及相关作用机制。方法：采用Aβ_25-35诱导PC12细胞建立Aβ毒性损伤细胞模型。将PC12细胞分为空白对照组、模型对照组、α-细辛醚组（0.5、1.0、1.5?μg/mL）、β-细辛醚组（6.3、12.5、25.0?μg/mL）、血管活性肠肽（VIP）组,并设VIP拮抗剂对照。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验检测炎症因子白介素（IL）-1、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α,氧化因子诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）和凋亡因子caspase-3、p53水平;蛋白质印迹法检测细胞c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）蛋白表达。结果：与模型对照组比较,α-细辛醚组、β-细辛醚组和VIP组细胞存活率增加,细胞凋亡率下降,凋亡因子caspase-3、p53和炎症因子IL-1、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,氧化因子iNOS和NO水平下降,c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38MAPK蛋白表达减少（均P<0.05）。VIP拮抗剂干预后,β-细辛醚组细胞存活率下降,细胞凋亡率增加,凋亡因子caspase-3、p53和炎症因子IL-1、TNF-α水平升高,IL-10水平下降,氧化因子iNOS和NO水平升高,JNK、p38MAPK蛋白表达增加（均P<0.05）;α-细辛醚组无显著变化（均P>0.05）。结论：α-细辛醚、β-细辛醚对Aβ_25-35诱导的PC12细胞损伤模型具有保护作用,β-细辛醚可通过促进VIP的分泌,调控JNK/MAPK通路从而抑制炎症因子、氧化因子水平,改善PC12细胞凋亡;α-细辛醚作用机制与VIP分泌水平无明显联系。