大肠癌中MT1-MMP和RECK基因表达的研究

目的探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)和RECK基因在大肠癌中的表达及其临床病理意义。方法采用免疫组织化学SP法检测216例大肠癌组织及20例正常大肠黏膜组织中MT1-MMP与RECK的表达,并分析它们的表达与大肠癌临床病理因素的关系。结果MT1-MMP蛋白在216例大肠癌组织中的阳性表达率为81.5%,在20例大肠正常黏膜中的阳性表达率为0(P<0.01);在Ⅰ Ⅱ与Ⅲ Ⅳ期的阳性表达率分别为67.1%和88.4%(P<0.01);在T1 T2与T3 T4两组的阳性表达率分别为72.5%和88.0%(P<0.05);在N0与N1 N2两组的阳性表达率分别为65.7%和89.0%(P<0.01);在M0与M1两组的阳性表达率分别为77.7%和94.0%(P<0.01)。RECK在216例大肠癌组织中的阴性表达率为41.7%,在20例大肠正常黏膜中的阴性表达率为0(P<0.01);在Ⅰ Ⅱ与Ⅲ Ⅳ期的阴性表达率分别为21.4%和51.4%(P<0.01);在T1 T2与T3 T4两组的阴性表达率分别为26.4%和52.8%(P<0.01);在N0与N1 N2两组的阴性表达率分别为25.7%和49.3%(P<0.01);在M0与M1两组的阴性表达率为34.3%和66.0%(P<0.01);RECK阴性表达组(5年生存率为25.6%)较阳性表达组(5年生存率为52.4%)预后差(P<0.01)。结论MT1-MMP蛋白在大肠癌中的表达与肿瘤分期、淋巴结转移、器官转移及预后有关,在大肠癌的侵袭、转移中发挥重要作用。     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型的影响

目的 以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORCl基因表达抑制后对VSMCs表型的影响.方法 实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性siRNA组.应用Western blot检测ORC1基因表达的变化;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构;应用流式细胞仪检测细胞表型标志蛋白表达.结果 ①siRNA转染后,阳性siRNA组ORCI基因表达水显著降低,而正常对照组及阴性siRNA组间ORC1基因表达水平无显著差异.②siRNA转染后,阳性转染组细胞呈现收缩型形态特征,空白对照组及阴性对照组细胞呈现合成型形态特征.③siRNA转染使ORCI表达减弱后,VSMCs收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)和平滑肌肌动蛋白重链2(SM-2)表达水平明显升高.合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin)表达水平明显降低,空白对照组及阴性对照组间3种标志物表达水平无显著差异.结论 RNA干扰介导的ORC1基凶沉寂可促使VSMCs由合成型向收缩型转化.     

RNA干扰抑制c-myc基因对体外培养大鼠血管平滑肌细胞活性的影响

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖是导致移植静脉再狭窄的主要原因之一,早期应答基因c-myc是促进平滑肌细胞持续增殖的关键基因。探讨针对c-myc基因的RNA干扰对体外培养平滑肌细胞增殖和活性的影响。方法体外培养大鼠VSMCs,构建3对针对c-myc基因的RNA干扰序列(siRNA-1#、siRNA-2#、siRNA-3#)和1组阴性对照序列,以Lipo2000为载体转染体外培养细胞,Q-RT-PCR检测c-myc mRNA表达,Western blot检测转染c-myc蛋白表达,MTT法检测细胞增殖状态和活性。结果转染3对siRNA序列48h后,各组c-myc mRNA表达水平显著低于阴性对照组和正常细胞组,3组转染组之间c-myc mRNA表达无显著差异。转染siRNA-1#、siRNA-2#序列后,c-myc蛋白表达低于转染siRNA-3#序列组、阴性对照组和正常细胞组,而转染siRNA-3#序列组c-myc蛋白表达与阴性对照组和正常细胞组相比无明显差异。转染24 h各组间细胞活性未见显著差异,48h时细胞活性与24h相比无显著增加,至72h时各组细胞活性有明显增加,以转染siRNA-1#序列组增加量最少。阴性对照组和正常细胞组抑制效率基本保持为零水平。转染siRNA-1#、siRNA-2#序列后,24、48、72 h后抑制效率逐渐增加,转染siRNA-3#序列后72h后其抑制效率开始降低,各相同时间点以转染siRNA-1#序列后抑制效率最高。结论体外转染c-myc基因siRNA序列,能显著降低平滑肌细胞c-myc基因mRNA和蛋白表达,抑制细胞活性和增殖。随着作用时间延长,RNA干扰(RNA interference,RNAi)后细胞活性缓慢增加,而抑制效应持续显著增加,以siRNA-1#序列抑制作用最为明显。     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1 A、ORC1 B、ORC1 C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

MT1-MMP 在乳腺癌中表达的研究

目的：探讨膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）表达与乳腺癌临床病理因素的关系。方法用免疫组化法检测69例乳腺癌组织及27例正常乳腺组织中MT1-MMP的表达水平,分析其与乳腺癌临床分期、淋巴结转移和器官转移的相关性。结果MT1-MMP蛋白在69例乳腺癌组织中阳性表达61例（88．4％）,在27例正常乳腺组织中无一例阳性表达（P＜0．01）;在T1＋T2与T3＋T4两组阳性表达为24例（77．4％）和37例（97．4％）（P＜0．05）;在N0＋N1与N2＋N3两组阳性表达为14例（70％）和47例（95．9％）（P＜0．01）;在M0与M1两组阳性表达为39例（82．98％）和22例（100％）（P＜0．05）。结论MT1-MMP蛋白参与了乳腺癌的浸润生长和扩散转移过程,是乳腺癌发生发展中的重要生物学事件。     

MT1-MMP在乳腺癌中的独特表达模式

目的探讨MT1-MMP在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达特点。方法采用免疫组化、半定量RT-PCR和原位杂交方法分别
检测43例乳腺癌组织中MT1-MMP蛋白和mRNA的表达,研究MT1-MMP在乳腺癌组织中的表达特点。结果采用免疫组化
方法检测乳腺癌组织中MT1-MMP蛋白表达,发现阳性染色位于癌细胞胞膜;而采用原位杂交的方法检测到MT1-MMP mRNA
的阳性染色位于乳腺癌癌巢周围的间质细胞。采用半定量RT-PCR方法检测癌组织中MT1-MMP mRNA表达,所有标本均有
MT1-MMP mRNA的表达,其中MT1-MMP免疫组化阳性染色的乳腺癌组织中相对表达量高（0.759±0.0802）;在MT1-MMP免
疫组化阴性染色的乳腺癌中相对表达量低（0.547±0.0886）,差异有统计学意义（P<0.01）。结论MT1-MMP 很可能是由乳腺癌
癌巢周围的间质细胞产生,激活后锚于癌细胞膜发挥作用,MT1-MMP在乳腺癌组织中的产生和作用有其独特的特点。
     

MMP17/MT4-MMP在胸主动脉瘤发病中的研究进展

MMP17/MT4-MMP是膜型基质金属蛋白酶-4,最新研究发现在遗传性胸主动脉瘤患者中存在R373H基因的突变,导致膜型基质金属蛋白酶4缺乏,骨桥蛋白是新发现的膜型基质金属蛋白酶4的一种作用底物,缺乏膜型基质金属蛋白酶4会引起水解产生的氨基端骨桥蛋白减少,进而影响JNK通路调控血管平滑肌细胞的发育,形成不成熟的血管平滑肌细胞,造成主动脉壁正常结构的破坏,在血管紧张素Ⅱ的诱导下形成主动脉瘤的几率增加。这与以往基质金属蛋白酶家族表达增加促进胸主动脉瘤的形成的结论不一致。     

MT1-MMP与甲状腺乳头状癌侵袭转移的研究进展

甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺癌,恶性程度较低,部分患者可出现淋巴结或远处转移,预后不佳。甲状腺乳头状癌的侵袭转移能力可能与膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)密切相关。在甲状腺乳头状癌等多种恶性肿瘤的浸润及转移过程中,MT1-MMP可发挥分解细胞外基质以及活化MMPs等作用,对疾病进展起到促进作用。对MT1-MMP抑制剂的研究是甲状腺乳头状癌靶向治疗药物的研究方向之一,目前针对MT1-MMP的不同作用已经研发出多种类型的靶向药物,对甲状腺乳头状癌的治疗具有重要意义。     

ox-LDL对人血管平滑肌细胞间质胶原酶及TIMP-1基因表达的影响

目的 研究氧化低密度脂蛋白（ox-LDL)与维生素C（Vitamin,C,VC)对平滑肌间质胶原酶及TIMP－1基因表达的影响。方法 采用Northern印迹杂交法检测ox-LDL与VC对人血管平滑肌细胞MMP－1及TIMP－1基因表达的影响。结果 ox-LDL可明显增加平滑肌细胞MMP－1基因的表达，VC可削弱ox-LDL对MMP－1表达的诱导作用，未经修饰的脂蛋白（nLDL)及VC单独作用，对MMP－1基因的表达无明显影响。结论 ox-LDL参与动脉粥样硬化斑块中基质降解，使动脉粥样硬化斑块易于破裂，适当地摄入维生素C等抗氧化剂可预防斑块的破裂。     

MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表达及三七总皂甙的干预作用

目的观察膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）在病毒性心肌炎小鼠中的表达及意义。方法选用近交系4~6周龄雄性BALB/C小鼠,采用随机数字表法分为3组：空白对照组、心肌炎组、治疗组。于病毒接种后第8、15、21天分别采血后处死小鼠并留取心脏标本。分别采用RT-PCR法及免疫组化法检测心肌MT1-MMP的mRNA及蛋白表达,光镜观察心肌组织病理改变。结果心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP的mRNA含量明显高于空白对照组（P＜0.01）,治疗组在第15、21天明显低于心肌炎组（P＜0.05或0.01）;心肌炎组和治疗组各时间点心肌细胞MT1-MMP免疫组化染色呈强阳性表达,空白对照组呈弱阳性。与心肌炎组比较,治疗组心肌细胞MT1-MMP表达在第15、21天降低,差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。结论MT1-MMP可能参与了病毒性心肌炎小鼠的发病,中药三七总皂甙可能通过降低MT1-MMP的表达起治疗作用。     

c-Fos基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型及迁移的影响

 目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞（VSMC） c-Fos基因,探讨c-Fos基因表达抑制后c-Fos siRNA 对平滑肌细胞表
型转换及迁移的作用。方法设置正常对照组、阴性siRNA 组及阳性siRNA 转染组。应用RT-PCR半定量法检测VSMC
中c-Fos和α平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）mRNA 的水平,采用Western blot 检测琢-SM-actin、碱性成纤维细胞生长因子
（bFGF）、内皮素1（ET-1）蛋白活性的变化,应用免疫荧光染色检测平滑肌分化标志蛋白琢-SM-actin,同时应用Transwell 检测平
滑肌细胞迁移能力。结果c-Fos siRNA 转染后阳性siRNA转染组c-Fos基因表达水平降低,而正常对照组与阴性siRNA组比
较c-Fos基因表达水平无统计学差异。siRNA 转染使c-Fos表达减弱后,VSMC 中α-SM-actin mRNA 和蛋白表达较正常对照组及
阴性siRNA组显著上调,bFGF、ET-1 表达减弱,VSMC 迁移速度减慢。结论RNA 干扰介导的c-Fos基因沉寂可在诱导VSMC
分化的同时抑制VSMC 迁移。     

大鼠血管平滑肌细胞的培养与鉴定

目的:改进大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养方法。方法:采用机械刮除、差异贴壁等手段进行组织贴块法原代培养,胰蛋白酶消化传代,并应用相差显微镜和即用型SABC免疫组化染色试剂盒对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果:镜下培养细胞呈典型的"谷-峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内-αactin阳性表达,锥虫蓝染色检测细胞传代成活率95%。结论:本法可获纯度高、结构和功能良好的VSMCs。     

Inhibitory Effects of Roscovitine on Proliferation and Migration of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Abnormal proliferation and migration of vascular smooth muscle cells （VSMCs） are the major cause of in-stent restenosis （ISR）. Intervention proliferation and migration of VSMCs is an im- portant strategy for antirestenotic therapy. Roscovitine, a second-generation cyclin-dependent kinase in- hibitor, can inhibit cell cycle of multiple cell types. We studied the effects of roscovitine on cell cycle distribution, proliferation and migration of VSMCs in vitro by flow cytometry, BrdU incorporation and wound healing assay, respectively. Our results showed that roscovitine increased the proportion of Go/G1 phase cells after 12 h （69.57±3.65 vs. 92.50±1.68, P=0.000）, 24 h （80.87±2.24 vs. 90.25±0.79, P=0.000） and 48 h （88.08±3.86 vs. 88.87±2.43, P=-0.427） as compared with control group. Roscovifine inhibited proliferation and migration of VSMCs in a concentration-dependent way. With the increase of concen- tration, roscovitine showed increased capacity for growth and migration inhibition. Roscovitine （30 μmol/L） led to an almost complete VSMCs growth and migration arrest. Combined with its low toxicity and selective inhibition to ISR-VSMCs, roscovitine may be a potential drug in the treatment of vascular stenosis diseases and particularly useful in the prevention and treatment of ISR.     

骨桥蛋白特异性短发夹RNA抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的应用特异性短发夹RNA(shRNA)抑制血管平滑肌细胞骨桥蛋白基因表达,观察其对体外培养的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法根据大鼠骨桥蛋白基因设计靶序列,采用体外转录方法获取shRNA,以此转染血管平滑肌细胞,采用逆转录-聚合酶链反应、Western blot等方法检测骨桥蛋白mRNA和蛋白的表达;用MTT法检测shRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果与未转染特异性shRNA细胞相比,转染shRNA的细胞中骨桥蛋白mRNA、蛋白表达量均明显降低,抑制率分别为(76.3±3.4)%和(68.7±4.6)%。血管平滑肌细胞的增殖也受到明显的抑制。结论设计的靶序列能有效沉默血管平滑肌细胞骨桥蛋白基因的表达,为进一步构建载体和体内研究奠定了基础。     

携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达。方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAd-GFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。采用CsC1密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化。获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平。结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5×1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%。结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础。     

韧粘素反义寡核苷酸对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨韧粘素 (TN)反义寡核苷酸 (ODN)对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的抑制作用。方法采用细胞计数及快速竞争性逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)等方法 ,观察不同剂量 ( 5、10、2 0 μg/ml)TN反义ODN和正义ODN对体外培养大鼠VSMC的增殖以及TNmRNA表达水平的影响。　结果TN反义ODN可有效抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖 ,作用呈剂量依赖性 (反义组 5、10、2 0 μg/ml剂量细胞计数分别为 10 5/ml× ( 4 .99± 0 .2 1)、( 4 .0 8± 0 .14 )、( 2 .85± 0 .39) ,对照组为 10 5/ml× ( 5 .95± 0 .41) ,(P <0 .0 5 ) ;TN反义ODN亦可下调TNmRNA表达水平 (反义组 0 .32± 0 .0 5 ,对照组为 0 .5 2± 0 .0 8;P <0 .0 1) ;而TN正义ODN则无上述作用。　结论TN反义ODN可能通过下调TNmRNA表达水平而抑制血管平滑肌细胞的增殖。     

实验性动脉内膜损伤后抑制血管平滑肌细胞增生的研究

目的 :观察血管内膜损伤后 c- m yc反义 RNA在抑制血管平滑肌细胞 (VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法 :选雄性日本大白兔 36只 ,经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时 ,局部给予 c- myc反义 RNA、正义 RNA及盐水 ,高胆固醇喂养 12周处死。测量内膜厚度 ,计数增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性细胞数。结果 :盐水及正义 RNA对照组动脉内膜明显增厚 (317μm) ,PCNA阳性细胞数明显增多 (6 2 % ) ,可见明显的粥样斑块灶形成。而反义 RNA治疗组内膜增厚度为 2 17μm,PCNA阳性细胞为 30 .5 % ,明显低于对照组 (P <0 .0 1)。结论 :c- myc反义 RNA具有显著抑制 VSMC增生 ,减轻粥样斑块形成的作用。     

二步酶消化法分离大鼠主动脉血管平滑肌细胞及活性鉴定

目的:建立一种有效、方便的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的酶解分离方法.方法:采用二步酶消化法分离VSM-Cs,显微镜下观察细胞形态,锥虫蓝染色观察细胞成活率,荧光显微镜检测细胞内钙荧光强度(FI)在KCl激下的变化,全细胞膜片钳记录电压-依赖性钾电流.结果:分离的VSMCs镜下呈典型的梭状或长条状,成活率达68.0％;VSMCs内钙FI在KCl刺激下可增高;并可记录到稳定的电压-依赖性钾电流.结论:本法可获得大量形态和结构良好的VSMCs,且胞膜离子通道功能良好.     

人类巨细胞病毒感染对血管平滑肌细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的研究人类巨细胞病毒感染对体外培养血管平滑肌细胞脂代谢相关基因表达的影响,探讨该病毒致动脉粥样硬化(As)的机制。方法以1 MOI人类巨细胞病毒感染体外培养的血管平滑肌细胞,利用基因表达谱芯片技术检测细胞脂代谢相关基因的表达变化。结果人类巨细胞病毒感染血管平滑肌细胞后,细胞内与脂代谢有关的基因表达出现明显的异常,其中表达上调的基因主要有低密度脂蛋白受体相关蛋白10、11、12、极低密度脂蛋白受体、B型清道夫受体、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶及脂肪酶合成酶等基因;表达下调的主要有载脂蛋白A1、载脂蛋白M和载脂蛋白H等基因。结论人类巨细胞病毒感染可能通过改变血管平滑肌细胞脂代谢相关基因的表达而参与As的发病过程。     

N-苄基氟哌啶醇氯化物对大鼠血管平滑肌细胞内钙离子的影响

目的:动态观察N_苄基氟哌啶醇氯化物(F3)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞内Ca2+的影响。方法:用Ca2+荧光染料Fluo_3_AM负载大鼠胸主动脉平滑肌细胞,在激光扫描共聚焦显微镜上测定细胞内游离钙的变化。结果:在含CaCl2(1.26mmol/L)的细胞外液中,30 mmol/L KCl使细胞内钙荧光强度(FI)迅速增强,F3可以拮抗KCl诱导钙FI增强作用,并呈量效依赖和时间依赖关系。4种浓度F3(0.01、0.1、1.0、10μmol/L)作用3 min时,使KCl诱导细胞内钙FI从(81±4)%分别降至(71±18)%(n=20,P<0.05)、(51±12)%(n=20,P<0.01)、(39±14)%(n=20,P<0.01)、(28±14)%(n=20,P<0.01)。钙FI变化最快的时程是在给药后的0~30 s。结论:F3通过阻断细胞膜电压依赖性钙通道降低平滑肌细胞内钙浓度,这可能是其扩张血管,改善心肌缺血的机制。