IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的 探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法 不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果 不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB...     

miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化

目的探讨miR-137对RUNX2的靶向作用及其对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法通过软件预测miR-137与成骨标志基因RUNX2的结合位点。检测MC3T3-E1细胞诱导成骨分化过程中miR-137的表达变化。转染miR-137 mimics或miR-137 inhibitor后,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,检测成骨分化标志物(RUNX2、ALP、OPN、OCN及OSX)表达变化。结果经软件预测,miR-137与靶基因RUNX2有结合位点。MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,miR-137表达下调。转染miR-137mimics的MC3T3-E1细胞成骨标志基因表达受到抑制,而转染miR-137 inhibitor组成骨标志基因呈不同程度表达上调。结论miR-137通过靶向作用RUNX2基因调控MC3T3-E1细胞成骨分化。     

LncRNA DANCR靶向调控对绝经后骨质疏松BMSCs成骨分化的作用

目的 研究长链非编码RNA（lncRNA）分化非蛋白编码 RNA（DANCR）靶向微小RNA（miR）-19a-3p对绝经后骨质疏松（PMOP）骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的调控作用。方法 选择健康女性志愿者4例和PMOP患者4例，分离培养BMSCs；PMOP患者BMSCs进行分组，转染阴性对照（NC）siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物。检测lncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN的表达水平，成骨诱导分化后检测茜素红染色的OD405水平、碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OCN）及骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达水平。结果 PMOP患者BMSCs中lncRNA DANCR、PTEN的表达水平高于健康女性，miR-19a-3p的表达水平及成骨诱导后的OD405水平、ALP活力、OCN及OPN的表达水平均低于健康女性。在PMOP患者BMSCs中，si-DANCR组的lncRNA DANCR、PTEN的表达水平低于si-NC组，成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平高于si-NC组；si-DANCR+miR-19a-3p抑制物组成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物组，PTEN的表达水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物组。结论 LncRNA DANCR靶向miR-19a-3p调控PMOP患者BMSCs的成骨分化。     

健骨胶囊对成骨样细胞MC3T3-E1增殖及分化作用机制

目的 探讨国医大师刘柏龄“健骨胶囊”对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法 制备健骨胶囊水提物,采用CCK-8法和细胞迁移实验检测健骨胶囊提取物对MC3T3-E1细胞增殖和细胞迁移的影响;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2、RASSF1A等mRNA表达水平;蛋白质印迹法Western blot检测Col1a1、Bcl2的蛋白表达水平。结果 通过实验结果比对得出,健骨胶囊提取物能促进MC3T3-E1细胞增殖、使细胞迁移率提高;同时健骨胶囊提取物组能明显提高MC3T3-E1细胞钙化能力(P＜0.01),促进Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2的mRNA表达(P＜0.05),上调Col1a1、Bcl2蛋白量的表达。结论 健骨胶囊能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖及细胞迁移能力,并通过上调成骨基因的表达水平如Runx2、OCN、OPN、Col1a1、ALP、Bcl2等,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

黄芩素通过BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨作用的实验研究

目的 探讨黄芩素（BAI）对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）成骨分化的作用及其分子机制。方法 将MC3T3-E1分为对照组（正常培养）和BAI组（以Baicalein处理）,在成骨分化条件培养下采用CCK-8检测BAI对MC3T3-E1细胞增殖的影响;分别以碱性磷酸酶染色（ALP）、茜素红染色（ARS）检测MC3T3-E1细胞成骨分化水平与矿化能力,实时荧光定量PCR检测成骨标志基因ALP、COL1A1、RUNX2、OSX的mRNA表达水平,通过免疫印迹法（Western-blot）检测MC3T3-E1细胞中BMP-2、Smad1、p-Smad1蛋白表达水平,通过免疫荧光技术（IF）检测RUNX2、COL1A1表达水平。结果 与对照组比较,BAI干预1 d后发现,BAI组COL1A1（P<0.001）、RUNX2（P <0.05）、OSX（P <0.05） mRNA表达水平在成骨分化中表达上升;干预3 d后发现,与对照组比较,BAI组ALP（P <0.05）、RUNX2（P <0.001）mRNA表达上升;干预7 d后发现,与对照组比较,BAI组COL1A1（P <0.05）mRNA表达水平较对照组上升,BMP-2、p-Smad1/Smad1蛋白表达水平上升（P <0.05）。免疫荧光中成骨标志蛋白RUNX2、COL1A1表达增多（P <0.05）。结论 BAI可通过激活BMP-2/Smad通路促进MC3T3-E1成骨分化。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

维生素D3及其代谢物对成骨细胞分化及生物矿化的实验研究

目的研究体外维生素D₃及其代谢物在不同浓度下对成骨细胞分化和生物矿化的影响。方法采用胶原酶消化法分离成骨细胞;设立对照组,不同浓度VD₃、25(OH)VD₃和1α,25(OH)2VD₃药物处理组。采用CCK-8法检测细胞增殖,采用PNPP法测定ALP活性,采用钙含量测定、ELISA法和实时定量聚合酶链反应来评估成骨细胞对VD₃及其代谢物的反应,并对成骨标志物进行分析,评价VD₃及其代谢物对成骨细胞分化和生物矿化能力的影响。结果VD₃及其代谢物对成骨细胞无细胞毒性,只有200 nmol/L的VD₃能显著促进成骨细胞增殖,而25(OH)VD₃和1α,25(OH)2VD₃对成骨细胞增殖的促进作用不明显。25(OH)VD₃和1α,25(OH)2VD₃可以上调成骨细胞CYP24A1基因的转录活性,但不能直接代谢VD₃和25(OH)VD₃。25(OH)VD₃和1α,25(OH)2VD₃以剂量依赖性增加的方式促进早期成骨标志物(Runx2,ALP等)的表达。只有25(OH)VD₃能促进成骨细胞OCN基因和蛋白的表达,提高成骨细胞的生物矿化水平。结论体外25(OH)VD₃可诱导成骨细胞的分化和生物矿化,为其在临床骨质疏松症和骨组织工程中的应用提供依据。     

2型糖尿病性骨质疏松大鼠ADSCs成骨能力的研究

目的探讨2型糖尿病性骨质疏松(DOP)大鼠自身脂肪干细胞(ADSCs)的体外成骨分化能力。方法将60只SD大鼠分为对照组、骨质疏松组(OP组)及2型糖尿病性骨质疏松组(DOP组),每组20只。DOP组大鼠喂食高脂高糖饲料后于左下腹部经腹腔注射STZ先建立2型糖尿病大鼠模型,再行卵巢切除术建立2型糖尿病性骨质疏松模型;OP组大鼠行卵巢切除术建立骨质疏松大鼠模型,对照组仅切除卵巢周围脂肪。对照组随机选取10只大鼠,DOP组及OP组从建模成功的大鼠中各随机选取10只作研究。从各研究大鼠腹股沟区脂肪组织中分离脂肪干细胞,培养并传代,取第3代细胞作成骨结节染色及定量分析,PCR检测成骨基因RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达。结果造模后DOP组大鼠BMD明显低于对照组及OP组(P0.05);三组大鼠ADSCs细胞形态学及增殖情况无显著性差异;显微镜下观察见DOP组与OP组ADSCs的钙化结节量较对照组少,DOP组钙化结节最少,并且缺少大片状结节,染色较浅;成骨定量分析结果可得DOP组ADSCs的OD值低于对照组及OP组,差异有统计学意义(P0.05);RT-PCR检测成骨基因的表达,DOP组与OP组RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达量均低于对照组(P均0.05),DOP组与OP组相比较,DOP组RUNX2与ALPmRNA的表达量明显低于OP组(P0.05),而OCN与OPNmRNA的表达量两组无明显差异(P0.05)。结论 DOP大鼠ADSCs成骨分化能力较弱,弱于单纯骨质疏松大鼠,原因可能与高血糖状态下其ADSCs中ALP和RUNX2的表达减少有关。     

MicroRNA-196a靶向调节HDAC9对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

目的 探究微小RNA（miR）-196a靶向调节组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组（Cont）组、诱导组、miR-196a-mimics-NC组、miR-196a-mimics组、miR-196a-inhibitor-NC组、miR-196a-inhibitor组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC组、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9组,根据分组转染后进行成骨诱导。定量荧光PCR检测MC3T3-E1细胞中miR-196a、HDAC9表达量;试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化程度;Western blot检测HDAC9、ALP、Runt相关转录因子2（Runx2）、胶原蛋白I（COL1）、骨桥蛋白（OPN）、Histone H3、Histone H3（acetyl K9、K14和K23）表达量。结果 与Cont组相比,诱导组MC3T3-E1细胞中miR-196a表达、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3 K9、K14、K23位点乙酰化水平增高（P＜0.05）,HDAC9 mRNA和蛋白表达降低（P＜0.05）。转染miR-196a-mimics可明显增加miR-196a表达,降低HDAC9表达,并增加ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表达、ALP活性、矿化程度及Histone H3乙酰化,转染miR-196a-inhibitor则作用相反。miR-196a可靶向下调HDAC9表达,过表达HDAC9可部分逆转miR-196a mimics对MC3T3-E1细胞成骨分化的促进效应。结论 miR-196a可靶向下调HDAC9表达,增加组蛋白乙酰化水平,促进MC3T3-E1细胞成骨分化。     

二苯乙烯苷调控miR-34a/SIRT1对骨质疏松大鼠的作用及机制研究

目的 探讨二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene glycoside,TSG)调控微小RNA-34a(miR-34a)/沉默信息调节因子1(SIRT1)对骨质疏松症(osteoporosis,OP)大鼠的作用及机制.方法 将60只SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、TSG组(80 mg/kg)、miR...