检测血清幽门螺杆菌细胞空泡毒素抗体的间接ELISA法初步建立

目的:以重组细胞空泡毒素(VacA)蛋白为抗原初步建立检测血清VacA抗体间接ELISA法,为制备检测Hp毒株感染的试剂盒奠定基础.方法:Ni-NTA2 树脂纯化重组VacA蛋白,用重组蛋白免疫兔,Helico Blot试剂盒检测兔血清VacA抗体以鉴定其免疫原性.Western blot检测其抗原性.并以纯化的重组蛋白为抗原,建立检测血清VacA抗体间接ELISA法,以Helico blot试剂盒为标准,确定该方法的特异性与敏感性.结果:以重组蛋白为抗原建立的检测血清VacA抗体的间接ELISA法,敏感性与特异性分别是93.1%和92.5%.结论:以重组蛋白为抗原初步建立检测血清VacA抗体的间接ELISA法,敏感性、特异性高,为制备商品化的试剂盒奠定了基础.     

胶体金免疫层析法快速定量检测蓖麻毒素

目的利用胶体金免疫层析技术,建立快速定量检测蓖麻毒素的方法。方法利用兔抗蓖麻毒素多克隆抗体作为标记抗体,标记胶体金颗粒;在硝酸纤维素膜上包被蓖麻毒素抗体(RCA)作为检测线,包被羊抗兔IgG抗体作为质控线,建立蓖麻毒素的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并利用胶体金生物传感器读取信号,拟合检测曲线,完成定量检测;对常见的食品进行模拟添加蓖麻毒素,评价方法的检测能力。结果研发的胶体金免疫层析试纸条可在15 min内完成检测,灵敏度为0.925μg/ml,线性范围0.925～14.8μg/ml;特异性、稳定性良好。结论建立的检测蓖麻毒素的胶体金免疫层析方法可对样品直接检测。     

Ⅰ型登革病毒prM抗体的制备及初步鉴定

目的以Ⅰ型登革病毒pr M蛋白为靶抗原,制备相应的多克隆和单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法 RTPCR扩增Ⅰ型登革病毒全长pr M基因,转入克隆载体和构建重组表达载体,以原核表达及纯化后的pr M蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,采集免疫兔血清,制备抗pr M蛋白多克隆抗体;取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选阳性克隆,获得特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备抗pr M蛋白单克隆抗体,应用亲和层析法纯化抗体,Western-blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体效价。结果获得全长pr M的多克隆抗体及1株能稳定分泌抗pr M蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体的效价高,特异性好。结论制备了Ⅰ型登革病毒pr M多克隆抗体和1株单克隆抗体,为进一步探讨登革病毒pr M抗体依赖的感染增强作用奠定基础。     

甲基苯丙胺的胶体金免疫层析检测卡的研制

目的建立一种无需仪器、敏感、特异并适用于非专业人员现场快速检测甲基苯丙胺(冰毒)的方法。方法用冰毒-BSA免疫BALB/C小鼠,采用有限稀释法筛选特异性单克隆抗体并用分型试剂盒分析抗体亚型。采用物理方法将胶体金标记纯化的抗体,组装胶体金快速检测卡并检测此卡的灵敏度和特异性。结果采用有限稀释法筛选出7株特异性分泌株,其中R6腹水纯化后间接竞争ELISA测其效价为108,分型试剂盒测试显示此抗体属于IgG1型;金标抗体量为5μg/ml时,胶体金免疫检测卡的灵敏度为500ng/ml,与8种结构类似物均无交叉反应。结论高灵敏度的胶体金免疫层析快速检测卡作为毒品的初筛工具可有效地帮助查禁人员现场缉毒。     

乙型脑炎病毒E结构域蛋白表达、纯化与胶体金的制备

目的分离乙脑病毒临床株,制备高纯度E蛋白抗原,制作用于乙脑病毒抗体检测的胶体金快速检测试纸条。方法 PCR扩增乙脑病毒E蛋白基因、使用原核表达系统进行融合表达、Ni-柱亲和纯化,透析复性后多点皮下免疫动物获得兔抗乙脑病毒E蛋白的多克隆抗体,免疫印迹法检测该抗体与重组蛋白结合的特异性。对抗体处理后,制备快速检测乙脑病毒的胶体金试剂。结果成功克隆出乙脑病毒E蛋白基因并表达该蛋白,纯化后免疫印迹显示在蛋白分子量53kDa左右显出1条目的条带(乙脑病毒E蛋白);酶联免疫法检测多克隆抗血清的效价达到1:12 800,与阴性血清不发生特异性反应。结论成功对乙脑病毒E蛋白基因进行了克隆表达,制备的胶体金试剂能检测出乙脑患者血清中的抗体,操作简便快速,具有临床推广意义。     

梅毒螺旋体外膜蛋白Tp0136的制备及在血清学诊断中的应用

目的:为探索梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,Tp)外膜蛋白Tp0136在早期梅毒诊断中的价值,利用基因重组技术制备Tp0136蛋白,用于血清抗体的检测。方法:采用PCR扩增Tp0136基因,构建不含信号肽序列的Tp0136基因原核表达载体,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,镍离子亲和凝胶分子筛二步法纯化目的蛋白,Western blot检测其免疫反应性,免疫日本大耳白兔评价其免疫原性,免疫双扩检测其效价,以rTp0136为包被抗原的间接ELISA检测早期梅毒血清抗体。结果:重组工程菌包涵体形式表达相对分子质量约为46 KDa的rTp0136,表达率为15%,制备得到纯度大于98%的rTp0136。纯化的rTp0136能诱导大耳白兔产生特异性免疫应答,免疫双扩测得其效价为1:32。Western blot检测重组蛋白能与兔抗Tp0136多克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测正常人血清均为阴性,而早期梅毒血清抗体的阳性率为75.1%。结论:重组Tp0136具有良好的免疫活性,预示其在早期梅毒血清学诊断中具有良好的前景。     

利用荧光免疫层析技术检测新冠病毒IgG抗体

目的 建立新冠病毒IgG抗体的快速检测方法.方法 制备并纯化重组新冠病毒N蛋白,将获得的重组N蛋白免疫家兔,获得多克隆抗体.将鼠抗人IgG单克隆抗体和兔抗新冠病毒N蛋白多克隆抗体分别喷于硝酸纤维素膜的检测线和控制线,用重组N蛋白标记荧光纳米颗粒作为标记抗原,建立荧光免疫层析方法.结果 重组新冠病毒N蛋白经表达纯化后,纯...     

贝氏柯克斯体重组抗原P1表达纯化及胶体金免疫层析方法的建立

目的制备贝氏柯克斯体的重组外膜蛋白P1,并建立一种快速检测贝氏柯克斯体抗体的胶体金免疫层析方法。方法利用贝氏柯克斯体主要的表面蛋白P1的良好免疫原性和免疫反应性,对已构建的表达P1抗原的重组工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达P1重组蛋白,通过蛋白纯化、复性、浓缩等过程获得目的蛋白。纯化的P1重组抗原包被硝酸纤维素膜,胶体金标记SPA,建立检测贝氏柯克斯体抗体的免疫层析方法,评价该方法的特异性、灵敏性、稳定性及应用性。结果纯化后获得分子质量(Mr)为52000的目的蛋白,纯度为94%。建立了快速检测贝氏柯克斯体特异性抗体的方法,对阳性参照样本检测,目测灵敏度可达1∶105,采用金标仪半定量检测灵敏度可达116ng/ml;对94份鼠血清和90份健康人血清检测,无阳性检出;对布鲁氏菌、普氏立克次体、军团菌、土拉弗朗西斯菌等传播途径和临床特征相似的病原抗体进行检测,未发生交叉反应。结论利用重组抗原建立的贝氏柯克斯体抗体胶体金免疫层析方法具有较好的敏感性和特异性,可用于传染病快速筛查。     

抗结核分支杆菌相关抗原单克隆抗体的制备及荧光抗体染色方法的建立

目的：制备抗结核分支杆菌的特异单克隆抗体，经纯化标记荧光后，建立直接荧光抗体染色方法用于痰标本的检测。方法：采用常规方法制备单克隆抗体。分泌单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选采用ELISA法，确认采用免疫印迹法。单克隆抗体的纯化采用饱和硫酸铵粗提，Sephadex G-50层析纯化。单抗纯化后采用透析法标记异硫氰酸荧光素，初步应用于临床痰涂片的检测。结果：经筛选获得4株单克隆抗体杂交瘤细胞株。ELISA检测小鼠腹水单克隆抗体效价达到1：6400～1：12800。免疫印迹实验表明4株单抗均为抗结核杆菌38KD蛋白单抗，其中两株产生较强的免疫反应条带。单抗纯化后标记异硫氰酸荧光素，建立直接荧光抗体染色方法，对41份结核病患者的痰标本进行检测，阳性率为90．24％，与抗酸染色法比较，直接荧光抗体染色方法敏感性明显高于抗酸染色法（P〈0．05）。结论：制备抗结核杆菌38KD蛋白的单克隆抗体，并建立直接荧光抗体染色方法，初步应用于临床痰涂片检测中，对于辅助诊断结核病具有一定价值。     

结核分枝杆菌Rv3428c重组蛋白表达与纯化及其单克隆抗体的制备

目的 制备并鉴定Rv3428c的单克隆抗体，为结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。方法 同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E.coli BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。结果 成功构建pET28a-Rv3428c表达载体、表达并纯化出目的蛋白。Rv3428c蛋白免疫小鼠使小鼠产生致敏B淋巴细胞，在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。筛选得到的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128 000,浓度为4 mg/ml。结论 本研究制备并纯化了Rv3428c重组蛋白，获得了抗Rv3428c单克隆抗体，为Rv3428c用于结核分枝杆菌快速特异性抗原检测奠定基础。     

两种胶体金免疫层析诊断试剂检测轮状病毒效果比较

目的比较两种A组轮状病毒胶体金免疫层析诊断试剂的灵敏度和特异度。方法用两种胶体金免疫层析试剂(万泰和拜发试剂盒)对166份腹泻患者粪便标本进行轮状病毒检测,与酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测结果进行比较。结果以ELISA方法为参照,万泰公司胶体金试剂的敏感度为84.6%(33/39),特异度为96.1%(122/127),阳性预测值和阴性预测值分别为86.8%(33/38)和95.3%(122/128);拜发公司胶体金试剂的敏感度为82.1%(32/39),特异度为96.9%(123/127),阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%(32/36)和94.6%(123/130)。结论本实验结果表明,胶体金免疫层析诊断试剂简便可靠,可用于A组轮状病毒的快速检测。     

两种不同方法检测HIV抗体结果比较

目的了解酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金(硒)免疫层析(GICA)两种不同方法检测HIV抗体的敏感性。方法采用ELISA和6个不同生产厂家GICA法检测,比较其最低检测下限。结果 6份样本稀释数万倍后ELISA法仍为阳性,GICA与ELISA法OD与值比较,不同生产厂家GICA法敏感性存在很大差异,ELISA法OD值<0.5,GICA法无一厂家试剂检出阳性,OD值>0.5只有1个厂家试剂检出阳性,其他厂家试剂均在ELISA法OD值>1.5~2.0才能检测出阳性。结论 ELISA法敏感性远高于GICA法,选择GICA法做HIV抗体筛查须慎重。     

同时检测优生4项IgM抗体免疫层析试纸条的制备优化

目的:建立一种新型胶体金免疫层析试纸条,用于同时检测优生4项IgM抗体。方法:选择与制备、检测胶体金免疫层析条有关的6个因素进行优化,根据优化结果,制备出同时检测优生4项IgM抗体的免疫层析试纸条。结果:同时检测层析条与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测阴性和阳性血清标本结果对比,发现巨细胞病毒IgM抗体(CMV-IgM)、风疹病毒IgM抗体(RV-IgM)、弓形虫IgM抗体(TOX-IgM)、单纯疱疹病毒IgM抗体(HSV-II-IgM)的总符合率分别为97.9%、100%、100%、100%。结论:4项IgM抗体同时检测层析条具有特异、稳定、操作简便、结果显示直观的优点,有广泛的应用价值。     

新型冠状病毒肺炎病例的血清学检测结果初步分析

目的 了解新型冠状病毒肺炎确诊病例、无症状感染者、密切接触者和其他相关人员血清中IgM和IgG抗体产生情况。 方法 采集研究对象的全血并及时分离血清,采用ELISA和胶体金法对确诊病例和无症状感染者血清进行IgM和IgG抗体检测,采用ELISA对密切接触者和其他相关人员血清进行检测。 结果 用ELISA和胶体金法进行抗体检测,42例确诊病例的阳性情况为:采样日期从第二周起,不论是IgM还是IgG的阳性率均出现增长,第15~35 d组,阳性率最高,IgM抗体阳性率ELISA和胶体金法分别为72.7%与36.4%,IgG抗体阳性率分别为72.7%与90.9%。用ELISA检测,8例无症状感染者为IgM阳性5例(62.5%)和IgG阳性5例(62.5%)。密切接触者为IgM阳性1例(1.7%)和IgG阳性2例(3.4%)。其他相关人员为IgM阳性1例(2.0%)和IgG阳性2例(4.1%)。ELISA IgM、胶体金IgM、ELISA IgG以及胶体金IgG试验检测出阳性确诊病例的发病日期至采样日期的间隔时间中位数分别为16、14、12、13 d。ELISA与胶体金法比对,IgM抗体检测的Kappa值为0.614,IgG的Kappa值为0.716。 结论 新型冠状病毒肺炎确诊病例血清抗体阳性率从第二周起出现显著增长,不同类型人员阳性率差异有统计学意义,ELISA与胶体金法比较中高度一致。     

利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立

〔目的〕建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法。〔方法〕利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立单增李斯特菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合标准曲线进行定量检测;在牛奶、橙汁、果冻等即食食品样品中添加单增李斯特菌模拟污染样品,评价该方法对半固体、液体等即食食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。〔结果〕该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线性范围3.5×105～3.5×108cfu/ml,回收率在99%～101.7%之间。〔结论〕建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地对样品中的单增李斯特菌进行定性、定量检测。     

特异性IgG4金标快速检测法在囊虫病诊断中的应用

目的 创建简易、快速、敏感的囊虫IgG4检测方法 ,研制一种快速准确的囊虫病诊断试剂.方法 以猪囊尾蚴囊液粗提液为检测用抗原,以胶体金标记抗人IgG4单克隆抗体为检测探针,采用自行设计的垂直流渗滤装置检测人血清中囊虫特异性IgG4抗体,平行检测IgG进行比较分析,并以囊虫IgG4 ELISA检测试剂为对照,评价其诊断价值.结果 用金标渗滤法检测人血清中囊虫特异性IgG4的敏感性和特异性分别为95.7%(90/94)、100.0%(50/50),与IgG检测结果 相近;与包虫病患者、裂头蚴病患者血清的交叉反应率分别为8.0%(4/25)、8.3%(4/24),低于IgG检测;未发现与肺吸虫病、血吸虫病患者血清有交叉反应.金标渗滤法快速检测囊虫IgG4在敏感件和特异性上略高于ELISA检测试剂,经x<'2>检验差异无统计学意义(x<'2>=2.77,P>0.05).结论 金标渗滤法快速榆测囊虫特异性IgG4,不仅操作简便、快速,而且敏感性高、特异性强,特别适合临床检测和现场查病,值得进一步开发应用.     

三种乙型肝炎表面抗原检测方法在口岸体检中的应用评估

目的循证检验医学(EBLM)指导下,对电化学发光法(ECLIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析法等3种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)检测方法进行评价,为口岸出入境人员寻求最佳的快速HBsAg检测方法和检测程序提供科学依据。方法ECLIA、ELISA、胶体金免疫层析法检测40份(HBsAg)标准血清盘标本,以血清盘预期结果为标准,比较3种方法灵敏度、特异度、总符合率。同时应用成本最小化分析方法,分别计算3种方法的成本。结果在血清盘HBsAg检测中,ECLIA法的灵敏度、特异性和总符合率皆达100.0%,Kappa值为1.000;而ELISA法国产科华试剂灵敏度76.9%、特异性100.0%和总符合率85.0%,Kappa值为0.432;胶体金免疫层析法灵敏度34.6%、特异性100.0%和总符合率57.5%,经Kappa检验其值为0.216。成本最小化分析结果显示:ECLIA法成本20元,ELISA法(科华,国产试剂)成本3元,胶体金免疫层析法成本3元,ECLIA法成本最高。结论ECLIA方法适用于需评估免疫状态,为接种疫苗做准备的出国留学人员、出国商务人员、入境留学生、入境商务人员的HBsAg检测。ELISA国产试剂适用于出国劳务人员、海员等一般人群。胶体金免疫层析法适用于紧急事情人员和日常复查的检测。     

四种梅毒血清学检测方法临床应用评价

目的:了解快速血浆反应素试验(RPR)、梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)、胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附试验(ELISA)的临床应用和价值。方法:采用RPR、TPPA、胶体金法和ELISA同时对4241例监测对象的标本进行检测,以TPPA作为参考标准,分别统计RPR、胶体金法和ELISA的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。结果:RPR、胶体金法、ELISA诊断梅毒的敏感性分别为66.80%、97.27%、98.18%,特异性分别为99.72%、99.43%、99.55%;胶体金法、ELISA与TPPA检测阳性率差异无统计学意义(P>0.05),RPR与TPPA法检测结果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TP-ELISA法具有较高的敏感性和特异性法,可用于临床筛查和梅毒感染的确证试验。     

ELISA法与胶体金法在检测新型冠状病毒血清抗体中的应用探讨

目的 探讨酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法与胶体金法检测新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)血清抗体的诊断价值。方法 选取湖南省新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎,COVID-19)确诊病例88例作为病例组,51例核酸检测阴性者作为对照组。采集研究对象血标本,采用ELISA法和胶体金法对所采集标本进行抗体检测,比较两种方法检出率差异;以核酸检测结果作为金标准,评估ELISA法和胶体金法的检验效能。结果 本研究结果显示,ELISA法和胶体金法检测2019-nCoV IgM 检出率均为20.97%,2019-nCoV IgG检出率分别为 43.55%、35.48%。不同采样时间ELISA法和胶体金法检测2019-nCoVIgM 检出率差异无统计学意义(均P>0.05)。发病-采样时间间隔≤7 d时,两种检测方法对2019-nCoV IgG检测结果差异有统计学意义(χ²=5.55,P=0.02),ELISA检出率(26.47%)高于胶体金法(5.71%)。通过对比不同发病-采样间隔发现,无论是ELISA法还是胶体金法,在一定时间内,间隔时间越长,2019-nCoV IgM和IgG检出率越高。以核酸检测结果为金标准,检测 IgG和IgM时,ELISA法和胶体金法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值差异均无统计学意义。结论 ELISA法与胶体金法检验效能相当,两者特异度高,但灵敏度上都存在局限性,不建议用于筛查,可以作为确诊的补充诊断手段或应用于聚集性疫情溯源。     

免疫滴金技术检测肾综合征出血热特异性抗体与中西医结合治疗的研究

目的　探索一种更为简便、快速、特异、灵敏的肾综合征出血热( HFRS) 抗体的检测方法及中西医结合治疗该病的有效手段。方法　115 例HFRS 病人血清同时采用免疫滴金法(CGIDA) 与酶联免疫吸附法(ELISA)对比检测特异性免疫球蛋白M 抗体( 抗HFRS- IgM) 、免疫荧光法(IFAT) 对比检测特异性免疫球蛋白G 抗体( 抗HFRS- IgG) ,并以20 例发热待排、48 例病毒性肝炎血清对照;101 例HFRS 病人分组进行中西医结合治疗,治疗组用苦黄、参麦注射液联合黄芪汤,对照组用利巴韦林联合甘利欣注射液。结果　115 例HFRS 病人血清,以CGIDA法检测抗HFRS- Ig M,灵敏度77 .4 % ,特异度100 % ;以CGIDA 法检测抗HFRS- IgG,灵敏度90 .4 % ,特异度100 % 。治疗组50 例与对照组51 例用药后退热天数、主要症状、体征缓解天数相似( P> 0 .05) ,尿蛋白消失及肾功能恢复天数,对照组优于治疗组( P< 0 .05) ,在越期方面,越休克期治疗组优于对照组( P< 0 .05) ,越少尿期及从发热期直接进入多尿期,两组情况相似( P> 0 .05) 。结论　CGIDA 检测HFRS 特异性抗体具有快速、简便、灵敏、特异之优点。苦黄、参麦注射液联合黄芪汤治疗HFRS 与利巴韦林联合甘利欣注射液相比较,疗效无明显差别,但前者优于改善休克情况,后者强于改善肾功能。