阿托伐他汀通过抑制ERK/MAPK信号通路改善H2O2诱导的血管内皮细胞损伤的机制研究

目的探究阿托伐他汀通过调节ERK/MAPK信号通路改善H₂O₂诱导的血管内皮细胞损伤的作用机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为空白对照组、模型组(H₂O₂处理)、阿托伐他汀组(阿托伐他汀+H₂O₂)、U0126组(ERK/MAPK信号通路抑制剂U0126+H₂O₂)、阿托伐他汀+LM22B-10组(阿托伐他汀和ERK/MAPK信号通路激活剂LM22B-10+H₂O₂)。采用MTT法、AO/EB染色法分别检测各组细胞活性、凋亡率;用酶联免疫吸附法检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;荧光法检测活性氧簇(ROS)水平;Western blot法检测各组细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组细胞增殖活性、SOD和GSH-Px含量降低,细胞凋亡率、LDH、MDA和ROS水平增加,p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达比值上调(P均<0.05)。与模型组比较,阿托伐他汀组细胞增殖活性、SOD和GSH-Px含量升高,细胞凋亡率、LDH、MDA和ROS水平降低,且p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达比值下调(P均<0.05)。与阿托伐他汀组比较,阿托伐他汀+LM22B-10组细胞增殖活性、SOD和GSH-Px含量降低,凋亡率、LDH、MDA和ROS水平升高,同时p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白表达比值上调(P均<0.05)。结论阿托伐他汀能够改善H₂O₂诱导的血管内皮细胞损伤,其机制与抑制ERK/MAPK信号通路进而降低ROS介导的血管内皮细胞凋亡和氧化应激损伤有关。     

三磷酸腺苷后处理通过RISK信号通路和mKATP减轻兔心肌缺血再灌注损伤

目的 探讨再灌注损伤挽救激酶(RISK)信号通路和线粒体ATP敏感性钾通道(mKATP)在三磷酸腺苷(ATP)后处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用.方法 选择60只雄性大耳白兔随机为缺血再灌注损伤组(IRI组)、ATP后处理组、PI3K抑制剂Wortmannin+ATP后处理组(Wortmannin+ATP组)、ERKl/2抑制剂PD98059+ATrP后处理组(PD98059+ ATP组)、选择性mKATP抑制剂5-HD+ ATP后处理组(5-HD+ ATP组),每组12只,建立心肌缺血再灌注模型.采用依文思蓝和四氮唑蓝双重染色测定心肌梗死面积,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表达.结果 ATP后处理组心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数明显低于IRI组(P＜0.01).Wortmannin+ ATP组、PD98059+ArP组和5-HD+ ATP后处理组心肌梗死面积、心肌细胞凋亡指数与IRI组比较差异无统计学意义.Westem blot检测显示,ATP后处理组p-Akt、p-ERK1/2表达水平明显高于IRI组(P＜0.05).结论 ATP后处理可通过缩小心肌梗死面积和减少心肌细胞凋亡发挥对缺血再灌注心肌的保护作用,其机制可能与RISK信号通路及mKATP有关.     

细胞外信号调节激酶通路在七氟醚后处理对抗大鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用

目的研究活性氧（ROS）、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）及线粒体通透性转换孔（mPTP）在七氟醚缺血后处理减轻离体大鼠心脏缺血-再灌注损伤中的作用。方法以K-H缓冲液灌注离体大鼠心脏,全心缺血30min后复灌60min建立缺血-再灌注损伤模型。七氟醚缺血后处理的心脏于缺血后复灌最初15min以3%七氟醚饱和的K-H缓冲液灌注。分别单独给予或与七氟醚同时给予ROS清除剂NAC（4mM）或ERK1/2阻断剂PD98059（20μM）,用以评价ROS及ERK1/2在七氟醚缺血后处理中的作用。比较各组间血流动力学、心肌梗死面积、冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）及肌酸肌酶-MB（CK-MB）水平。同时,测定各组缺血30min复灌60min后心肌丙二醛（MDA）含量以反映氧化应激损伤程度。Western blotting测定ERK1/2的磷酸化情况。测定心肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）含量以反映mPTP的开放情况。结果与对照组相比,复灌之初给予3%七氟醚可显著改善心功能（增加左室发展压力、左室最大收缩/舒张速率、冠脉流量、心率,并降低左室舒张末期压力）、降低心肌梗死面积及减少LDH及CK-MB释放（P〈0.05）。七氟醚的心肌保护作用同样表现在降低缺血-再灌注损伤后心肌的MDA含量（P〈0.05）。然而,给予NAC或PD98059不仅可消除上述保护作用,而且可以抑制七氟醚增强ERK1/2磷酸化及抑制mPTP开放的保护作用（P〈0.05）。结论 3%七氟醚缺血后处理通过ROS-ERK1/2-mPTP信号通路可为健康大鼠离体心脏的缺血-再灌注损伤提供保护。     

血小板衍生生长因子BB激活细胞外信号调节激酶1/2参与血管新生内膜形成

目的血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)是介导血管新生内膜形成最重要的生长因子之一,本研究探讨PDGF-BB激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)参与血管新生内膜的形成。方法在整体实验上,将24只250g健康雄性SD大鼠分为3组:A组为假手术组;B组为颈动脉球囊损伤组;C组为颈动脉球囊损伤干预组(ERK1/2抑制剂PD98059)。建立颈动脉球囊损伤模型后,经血管外膜途径局部给予PD98059抑制ERK1/2激活,苏木精-伊红(HE)染色分析损伤血管形态学变化,免疫荧光检测巨噬细胞浸润。原代培养外膜成纤维细胞,Western blot检测细胞ERK1/2的激活,划痕实验观察细胞迁移变化。结果损伤组新生内膜面积和内膜中膜比大于干预组[(0.149±0.012)比(0.077±0.021)mm2,1.137±0.088比0.682±0.141,均P0.01]。损伤组管腔面积小于干预组[(0.249±0.021)比(0.314±0.016)mm~2,P0.05]。同时,PD98059能明显改善新生内膜形成,伴随巨噬细胞浸润明显减少。20μg/L PDGF-BB瞬时激活ERK1/2在5min时磷酸化ERK1/2表达最高,并且ERK1/2的激活能够被PD98059所抑制。PD98059也抑制PDGF-BB促进外膜成纤维细胞的迁移。结论经外膜干预ERK1/2激活可以改善损伤诱导的新生内膜形成,可能是通过抑制PDGF-BB介导的外膜成纤维细胞的迁移。     

芦丁对大鼠离体心脏冠脉流量和血流动力学参数的影响

目的研究芦丁对大鼠离体心脏冠脉流量(CF)及血流动力学参数的影响。方法利用Langendorff实验系统,将36只大鼠随机分为6组,每组6只,观察溶剂及不同浓度芦丁(0.3μmol/L,1μmol/L,3μmol/L,10μmol/L,30μmol/L)对大鼠离体心脏冠脉流量及血流动力学参数的影响。先用正常台式液灌流大鼠心脏,待各指标稳定后,记录冠脉流量(CF)、左心室收缩压(LVDP)、左心室舒张压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。30min后,用含溶剂或芦丁的台式液灌流大鼠心脏,再记录各参数。观察芦丁对大鼠离体心脏冠脉流量及血流动力学参数的影响。结果 0.3μmol/L,1μmol/L,3μmol/L,10μmol/L,30μmol/L芦丁浓度依赖性增大CF值,使CF值从7.3mL/min±1.2mL/min增大到12.6mL/min±1.1 mL/min;芦丁浓度依赖性增大LVDP值和+dp/dtmax值,使LVDP值从60mmHg±2mmHg增大到73mmHg±4mmHg,使+dp/dtmax值从1 135mmHg/s±102mmHg/s增大到1 427mmHg/s±115mmHg/s;不同浓度芦丁对LVEDP和-dp/dtmax值无显著影响。结论芦丁增加离体大鼠心脏冠脉流量,对离体大鼠心脏有正性肌力作用。     

细胞外调节蛋白激酶在大鼠急性坏死性胰腺炎发病机制中的作用

目的 研究细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated kinase 1/2,ERK1/2)信号转导通路在大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)时的变化规律,探讨ERK1/2特异性抑制剂PD98059对ANP时胰腺的保护作用.方法 以5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立ANP模型,5只大鼠作为正常组,余75只大鼠按数字表法随机分为假手术组、ANP组及PD98059组,各25只.术后15 min、30 min、1 h、3 h和6 h分批处死动物,取血及胰腺组织.常规胰腺病理检查并评分;ELISA方法检测大鼠血清IL-1β、TNF-α水平;酶化学法检测胰腺组织内MPO活性;Western blotting法检测胰腺组织磷酸化ERK1/2的表达量.结果 假手术组胰腺无明显病理改变;ANP组胰腺损伤明显,3 h的病理评分为9.9±0.4,PD98059组胰腺损伤减轻,3 h病理评分为4.0±0.4,与ANP组相差显著(P<0.05).假手术组、ANP组和PD98059组大鼠3 h时血清TNF-α水平分别为(65.8±20.5)pg/ml、(286.5±50.3)pg/ml、(180.4±32.9)pg/ml;IL-1β水平为(85.8±25.5)pg/ml、(293.8±46.3)pg/ml、(200.5±33.6)pg/ml;胰腺MPO活性为(0.19±0.02)U/g、(0.61±0.05)U/g、(0.52±0.03)U/g.ANP组和PD98059组均显著高于假手术组,而PD98059组又显著低于ANP组(P值均<0.05).正常大鼠胰腺磷酸化ERK1/2表达量为1100±141;ANP组15 min、30 min时磷酸化ERK1/2表达量分别为5300±486、5621±384,1 h开始下降,6 h时几乎与假手术组相似;PD98059组造模后15 min、30 min的磷酸化ERK1/2表达量分别为4200±370、3600±290,显著低于同时间点ANP组(P值均<0.01).结论 ERK1/2信号转导通路参与大鼠ANP发病机制,PD98059干预可减少IL-1β、TNF-α的产生,降低胰腺组织MPO活性,改善胰腺的病理损伤程度.     

转化生长因子β1对不同阶段支气管哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞外信号调节激酶通道的影响

目的 本文旨在探讨转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)对不同阶段(急性和慢性)支气管哮喘(简称哮喘)大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)上细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2 mRNA、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平的影响.方法 建立2周、6周哮喘大鼠模型,用TGF-β1和ERK的特异性抑制剂PD98059干预哮喘大鼠ASMC的培养.用RT-PCR检测不同阶段哮喘大鼠模型ASMC上ERK1/2 mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测p-ERK1/2蛋白的表达及定位.结果 与正常对照组ASMC比较,2周、6周哮喘组ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率显著增高.经PD98059干预之后,2周、6周哮喘组ASMC的ERKmRNA、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率均显著降低.经TGF-β1干预后,2周、6周哮喘组ASMC的ERK mRNA、p-ERK1/2蛋白的表达量较各自哮喘组显著增高,而这一作用可以被PD98059部分抑制.但以上结果 2周和6周哮喘模型组之间差异无统计学意义.结论 TGF-β1可上调不同阶段哮喘大鼠ASMC上ERK1/2 mRNA及p-ERK1/2表达.在哮喘的不同阶段,TGF-β1可能持续通过促进ERK信号转导通道的活性对ASMC的增殖进行调控.     

UTP减轻大鼠心脏缺血/再灌注损伤的作用

目的:探讨P2Y受体激动剂尿苷三磷酸(UTP)对于大鼠心脏缺血/再灌注损伤(I/RI)的延迟性拮抗作用。方法:24只SD大鼠随机分为4组:实验对照组、UTP组、UTP+苏拉明(suramin,SRM)组及SRM组。所有大鼠尾静脉给药24 h后,建立Langendorff离体心脏灌流模型。平衡10 min后全心停灌,25 min后复灌,持续再灌40 min。观察心脏再灌注前后血流动力学指标及心肌超微结构,记录心脏表面心电图计算心律失常的发生率,收集冠脉流出液,用全自动生化分析仪测量乳酸脱氢酶(LDH)的水平。结果:复灌后第5 min和25 min时,UTP组的左室发展压(LVDP)、左室压力微分(±dp/dtmax)恢复率均优于实验对照组(P0.05,P0.01);冠脉流出液中LDH的水平明显值降低(P0.01);复灌第5~15 min和第25~35min时的心律失常的发生频率均显著下降(P0.05,P0.01);心肌超微结构的损伤减轻。而以SRM与UTP同时作用后,UTP对心脏的保护作用则被取消。SRM组与实验对照组相比各项指标无明显变化。结论:UTP预处理可对心脏I/RI产生延迟性拮抗作用;而P2Y受体拮抗剂SRM可取消这种作用,表明UTP对心脏的保护作用是通过P2Y受体介导的。     

结缔组织生长因子诱导大鼠心肌细胞肥大的作用及其与细胞外信号调节激酶1/2的关系

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)诱导大鼠心肌细胞肥大的作用,探讨其作用与细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的关系.方法 以培养的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞为实验模型,用图象分析法测定心肌细胞表面积,用[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,用考马斯亮兰法测定心肌细胞蛋白含量,用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定心肌细胞总ERK1/2(t-ERK1/2)与磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达水平.结果 (1)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞表面积呈剂量依赖性增加,其中10、25、50、100 μg/L的CTGF组心肌细胞表面积分别为(929.9±132.2)、(1411.3±129.2)、(1732.0±153.0)、(2040.6±205.4)μm2,均明显高于对照组心肌细胞表面积[(606.3±72.7)μm2,P均＜0.01];100 μmol/L的PD98059明显减少CTGF诱导的心肌肥大(P＜0.01).(2)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞蛋白合成速率与蛋白含量呈剂量依赖性增加,CTGF组心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率明显高于对照组(P＜0.01);ERK1/2抑制剂PD98059明显减少CTGF诱导的心肌细胞[3H]-亮氨酸掺入率及蛋白含量(P＜0.01).(3)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞p-ERK1/2表达呈剂量依赖性增高,5、10、25、50、100 μg/L的CTGF组的心肌细胞p-ERK1/2表达明显高于对照组,而t-ERK1/2在各组表达差异不明显.结论 CTGF可诱导心肌细胞肥大,该作用可能是通过ERK1/2的磷酸化来实现的.     

ERK1/2通路在TIMP-1抑制大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路是否参与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)抑制大鼠肾小球系膜细胞的凋亡。方法选择大连医科大学附属第一医院2005年8月至2006年2月应用人正、反义TIMP-1转染大鼠肾小球系膜细胞,分别用高糖(25mmol/L)和MEK1特异性抑制剂PD98059(50μmol/L)刺激24h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)观察细胞外信号调节激酶信使RNA(ERK1 messenger RNA)的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测胞浆中p-ERK1/2的表达情况。结果(1)未加PD98059的未转染组、空载体组、正义转染组及反义转染组各组细胞的凋亡率分别为(12.10±2.21)%、(11.90±3.34)%、(5.50±0.50)%和(20.70±3.41)%;正义转染组的凋亡率明显低于未转染组(P<0.01);反义转染组凋亡率高于未转染组(P<0.05)。加入PD98059后各组细胞的凋亡率明显增加。(2)加入PD98059后,各组细胞ERK1mRNA的表达较相应未加PD98059各组明显上调;以正义转染组上调最为明显。(3)ELISA结果显示:加入PD98059后,p-ERK1/2较相应未加PD98059各组明显下调(P<0.05),以正义组下调最为明显(P<0.01)。结论ERK1/2信号传导通路是TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的主要途径之一。     

细胞外信号调节激酶通路介导的自噬对七氟烷后处理大鼠心肌缺血再灌注的保护机制

目的研究七氟烷后处理(SP)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用,探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)转导通路介导的自噬在其中的机制作用。方法成年雄性SD大鼠90只,建立急性大鼠心肌I/R损伤模型。随机分为6组:假手术组(Sham组)、I/R组、SP组、七氟烷正常对照组(Control组)、ERK1/2抑制剂PD98059组(PD组)、PD98059溶剂DMSO组(DMSO组),各15只。后5组缺血30min,再灌注4h。再灌注4h末提取心脏,用TTC法测定心肌梗死范围,用Western blot法检测Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ及P62蛋白表达水平。结果与I/R组比较,SP组心肌梗死范围减小[(35.7±10.1)%vs(56.4±12.3)%,P<0.05],LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62蛋白表达下调(P<0.05);与SP组比较,PD组心肌梗死范围增加[(50.7±8.3)%vs(35.7±10.1)%,P<0.05],LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和P62蛋白表达上调(P<0.05)。结论 SP减轻了大鼠心肌I/R损伤,其机制可能是通过激活ERK1/2信号转导通路,抑制再灌注期间自噬体清除的破坏,进而抑制再灌注期间细胞死亡。     

细胞外信号调节激酶1/2途径参与甲状旁腺素1-34诱导的心肌细胞肥大

目的 观察丝裂素活化蛋白激酶的上游激酶1(MAPKK,MEK1)抑制剂PD98059对大鼠甲状旁腺素1-34(rPTH1-34)诱导的心室肌细胞肥大的影响及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的变化,分析MEK/ERK途径的可能作用. 方法 体外培养新生大鼠心室肌细胞,10-7mol/LrPTH1-34诱导建立心肌细胞肥大模型,在模型中加入2×10-5mol/L PD98059,Motic Images Advanced 3.0软件测定细胞直径、3H-亮氨酸掺入实验检测细胞蛋白合成速率、RT-PCR半定量测定心房利钠肽mRNA、Western blot方法观察ERK1/2、磷酸化ERK1/2蛋白表达的变化. 结果 与正常组相比,10-7mol/L rPTH1-34孵育24 h可使体外培养的心肌细胞直径增加13.6 μm、细胞蛋白合成速率增加898 cpm/well,使心房利钠肽mRNA表达增加73.9%,p-ERK1/2蛋白表达增加15%(P＜0.05).与PTH组相比,预先给予PD98059可使细胞直径减少7.1 μm,细胞蛋白合成速率减少644 cpm/well,心房利钠肽mRNA表达下降52.2%,磷酸化ERK1/2蛋白表达减少18%(P＜0.05).单独使用PD98059对正常心肌细胞没有影响(P＞0.05). 结论 PD98059通过抑制ERK1/2、磷酸化ERK1/2的表达阻断了心肌细胞肥大反应,MEK/ERK1/2途径的活化参与了rPTH1-34的致肥大作用.     

α-烯醇化酶在内皮素-1诱导的肥大心肌细胞中的表达和调控通路

目的 观察内皮素-1(ET-1)诱导的心肌细胞肥大模型中细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)、低氧诱导因子(HIF-1α),α-烯醇化酶(α-enolase)蛋白表达情况,探讨肥大心肌细胞α-enolase高表达的调控机制. 方法 建立ET-1诱导的心肌细胞肥大模型,从细胞表面积、细胞蛋白合成速率和肌原纤维的重排3方面进行验证;将原代培养心肌细胞随机分为4组:(1)对照组;(2)PD98059干预组;(3)ET-1刺激组;(4)PD98059+ET-1刺激组.免疫印迹方法 检测ERK1/2、p-ERK1/2、HIF-1α、α-enolase的蛋白表达. 结果 ET-1刺激后心肌细胞表面积为(1350.7±107.5)μm2,较对照组(896.1±70.2)μm2增加(P<0.05);ET-1刺激后心肌细胞[3H]亮氨酸掺入量较对照组增加[分别为(1387.9±14.8)dpm和(787.7±10.2)dpm,P<0.013;肌原纤维染色可见ET-1刺激屙心肌细胞肌原纤维排列较对照组紧密、染色浓,表明ET-1能诱导心肌细胞肥大.ERK1/2抑制剂PD98059预处理的心肌细胞在ET-1刺激后细胞表面积和细胞的[3H]亮氨酸掺入量均较ET-1刺激组减少[细胞表面积分别为(907.0±92.5)μm2和(1350.7±107.5)μm2,P<0.05;[3H]亮氨酸掺入量:(841.5±10.5)dpm和(1387.9±14.8)dpm,P<0.05].ET-1刺激后心肌细胞有p-ERK1/2表达,其抑制剂PD98059在抑制ERK1/2活化的同时也部分抑制了HIF-1α、α-enolase蛋白的表达. 结论 ERK1/2的活化与ET-1诱导的细胞肥大关系密切,在ET-1促心肌细胞肥大过程中,从MAPK/ERK1/2至HlF-1α及α-enolase这条信号通路町能参与α-enolase高表达的调控.     

蛋白激酶Cα-胞外调节蛋白激酶1/2与人气道平滑肌细胞中周期蛋白D1及P21cip1 表达的关系

目的 探究蛋白激酶C(PKC)α-胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2级联对支气管哮喘(简称哮喘)患者血清被动致敏的人气道平滑肌细胞(HASMC)周期蛋白D1(cyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂P21 cipl的调节作用及细胞增殖的影响.方法 用含10%哮喘患者血清的DMEM培养基被动致敏HASMC后,按随机数字表法分为对照组、12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)处理组、PMA+PKCα错配寡核苷酸组、PMA+PKCα反义寡核苷酸组以及PMA+U0126组,每组4个样本.用Western blot方法检测各组细胞磷酸化PKCα(p-PKCα)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、cyclinD1和P21 cipl的蛋白表达水平,用流式细胞术和四甲基偶氮唑盐(MT)法检测HASMC增殖.结果 PMA处理组p-PKCα水平、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平高于对照组,cyclinD1、P21 cipl表达明显强于对照组(相对于各对照组的A值分别为2.10±0.29、1.67±0.19、2.20±0.27、1.99±0.22和3.11±0.29,均P＜0.05),HASMC的增殖[S期细胞比例为(30.3±2.4)%,A490值为0.80±0.06]高于对照组[S期细胞比例为(13.9±2.6)%,A490值为0.41±0.04],均P＜0.05;PMA+PKCα反义寡核苷酸组中p-PKCα水平低于PMA处理组,ERK1/2和p-ERK1/2表达明显弱于PMA处理组,cyclinD1和P21 cipl 表达也明显低于PMA处理组(相对于各对照组的A值分别为1.23±0.19、1.34±0.18、1.52±0.20、1.45±0.18和1.49±0.18,均P＜0.05),HASMC的增殖显著下降[S期细胞比例为(21.2±2.8)%,A490值为0.51±0.04;q值分别为6.07,12.63;均P＜0.05];同样与PMA处理组相比,PMA+U0126组中p-PKCα水平无明显改变(A值为1.99±0.18,q=0.94,P＞0.05),但ERK1/2、P-ERK1/2的表达,cyclinD1和P21 cipl的表达明显低于PMA处理组A值分别为0.95±0.21、1.15±0.19、1.37±0.15和1.96±0.21,均P＜0.05),HASMC的增殖显著下降[S期细胞比例为(22.0±3.2)%,A 490值为0.49±0.03;q值分别为5.51、13.45,均P＜0.05].结论 ERK1/2是PKCα的下游信号分子,PKCα-ERK1/2级联参与了PMA所诱导的哮喘患者血清被动致敏的人气道平滑细胞cyclinD1、P21 cipl的表达上调及细胞增殖.     

白藜芦醇通过c-fos通路对AMI大鼠心肌损伤标志物含量的影响

目的 探究白藜芦醇(RSV)通过即刻早期基因(c-fos)通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤标志物含量的影响。方法 选取48只SD大鼠随机分为Sham组、AMI组和AMI+RSV组,每组各16只。通过结扎建立AMI模型,AMI+RSV组使用RSV灌胃干预(10 mg·kg/d)。检测各组大鼠心功能和心肌损伤标志物肌酸激酶MB(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)。HE染色和TUNEL染色检测组织损伤和心肌细胞凋亡。Western blot检测细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化的ERK(p-ERK)和c-fos水平。结果 AMI组大鼠左室射血分数(LVEF)及左室内压力最大变化率(±dp/dtmax)水平显著低于Sham组(P0.05),AMI+RSV组LVEF、±dp/dtmax水平显著高于AMI组(P0.05)。AMI组CK-MB和LDH水平显著高于Sham组(P0.05),AMI+RSV组CK-MB和LDH水平显著低于AMI组(P0.05)。AMI组凋亡率(38.75%±4.36%)显著高于Sham组(4.54%±0.58%,P0.05),AMI+RSV组心肌细胞凋亡率(19.67%±4.18%)显著低于AMI组(P0.05)。AMI组p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平显著高于Sham组(P0.05),AMI+RSV组p-ERK/ERK和c-fos蛋白水平显著低于AMI组(P0.05)。结论 RSV通过调节c-fos通路抑制AMI模型大鼠的心肌细胞凋亡,缓解心肌细胞损伤并发挥保护AMI后心功能的作用。     

左卡尼汀对离体家兔心脏缺血再灌注损伤的保护作用

将离体兔心灌注模型随机分成三组,正常对照组连续灌注K-H液60 min;缺血再灌注组关闭主动脉套管停止灌注,30 min后恢复37℃K-H液灌注60 min;左卡尼汀组步骤同缺血再灌注组,但在复灌时先用含10mmol/L左卡尼汀的K-H液灌注30 min。记录冠脉流量、左心室发展压（LVDP）、左心室压力时间变化率（±DP/DT）;检测冠脉流出液中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）浓度和心肌组织中MDA、SOD含量。结果左卡尼汀组±DP/DTmax、LVDP较缺血再灌注组显著升高,冠脉流量增大;冠脉流出液中MDA、LDH、CK及心肌组织中MDA水平降低,SOD水平升高（P〈0.05）;超微结构损伤减轻（P〈0.05）。表明左卡尼汀具有抗兔离体心脏缺血再灌注损伤的作用。     

晚期糖基化终产物对结肠癌干细胞增殖及凋亡的影响研究

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对结肠癌干细胞AGEs受体(RAGE)表达及增殖和凋亡的影响。方法以人SW480结肠癌干细胞为研究对象,不同浓度AGEs及50μmol/L PD98059、40mmol/L二甲双胍(MET)干预结肠癌干细胞后,分别应用RT-PCR和Western blot检测24h细胞RAGE mRNA和RAGE、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表达;CCK-8检测24h细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡。结果应用不同浓度(100、200、300μg/ml)AGEs干预后,与Con组(未加AGEs)比较,200μg/ml AGEs组RAGE mRNA和蛋白表达均增加,(p-ERK1/2)/(ERK1/2)也升高(P0.05)。PD98059干预后,RAGE蛋白表达及(p-ERK1/2)/(ERK1/2)均降低。与不同浓度(100、200、300、500μg/ml)BSA组比较,相应浓度(100、200、300、500μg/ml)AGEs组细胞吸光度(OD)升高(P0.05),细胞活力分别增加11.6%、16.3%、13.8%、13.9%。200μg/ml AGEs组PD98059干预,细胞OD值下降(P0.05)。24h后,200μg/ml AGEs组细胞凋亡率与Con组比较,差异无统计学意义(P0.05),MET组细胞凋亡率升高(P0.05);与MET组比较,MET+AGEs组凋亡率降低(P0.05);与MET+AGEs组比较,MET+AGEs+PD组凋亡率升高(P0.05)。结论 AGEs可促进结肠癌干细胞增殖,抑制其凋亡,作用机制可能是通过作用于RAGE,上调其表达量,激活ERK1/2通路来实现。     

结缔组织生长因子诱导大鼠心肌细胞肥大的作用及其与细胞外信号调节激酶1/2的关系

目的观察结缔组织生长因子(CTGF)诱导大鼠心肌细胞肥大的作用,探讨其作用与细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的关系。方法以培养的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌细胞为实验模型,用图象分析法测定心肌细胞表面积,用[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,用考马斯亮兰法测定心肌细胞蛋白含量,用蛋白免疫印迹法(Westernblot)测定心肌细胞总ERK1/2(t-ERK1/2)与磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白表达水平。结果(1)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞表面积呈剂量依赖性增加,其中10、25、50、100μg/L的CTGF组心肌细胞表面积分别为(929·9±132·2)、(1411·3±129·2)、(1732·0±153·0)、(2040·6±205·4)μm2,均明显高于对照组心肌细胞表面积[(606·3±72·7)μm2,P均<0·01];100μmol/L的PD98059明显减少CTGF诱导的心肌肥大(P<0·01)。(2)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞蛋白合成速率与蛋白含量呈剂量依赖性增加,CTGF组心肌细胞[3H]亮氨酸掺入率明显高于对照组(P<0·01);ERK1/2抑制剂PD98059明显减少CTGF诱导的心肌细胞[3H]亮氨酸掺入率及蛋白含量(P<0·01)。(3)随着CTGF浓度的增加,心肌细胞p-ERK1/2表达呈剂量依赖性增高,5、10、25、50、100μg/L的CTGF组的心肌细胞p-ERK1/2表达明显高于对照组,而t-ERK1/2在各组表达差异不明显。结论CTGF可诱导心肌细胞肥大,该作用可能是通过ERK1/2的磷酸化来实现的。     

虎杖苷通过PKC对大鼠离体缺血再灌注心肌的保护作用

目的:研究虎杖苷(polydatin,PD)对大鼠离体缺血/再灌注(I/R)心肌的保护作用。方法:将40只SD大鼠随机分为4组,包括I/R组,PD(I/R+PD)组,虎杖苷+蛋白激酶C(PKC)阻断剂(I/R+PD+chelerythrine)组和PKC阻断剂(I/R+chelerythrine)组。采用Langendorff灌流法建立离体心肌I/R模型,缺血40 min,再灌注共40 min,分别测量再灌20 min以及再灌40 min时心功能和酶学指标包括:心率、左室收缩压(LVDP)、左室舒张末压(LVEDP)、心室内压最大变化速率(±dp/dtmax)及磷酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)浓度。结果:心肌I/R可引起心脏功能I/R+PD组±dp/dtmax的恢复率明显回升(P0.05),同时,LVEDP、LVDP等指标也有明显改善(P0.05),LDH、PK浓度在复灌20和40 min时明显低于I/R组(P0.05)。说明PD能部分抑制再灌注期PK和LDH的漏出。PD还能够显著提高I/R心肌的超氧化物歧化酶(SOD)水平,并且降低丙二醛(MDA)水平,发挥心肌保护作用。应用PKC抑制剂chelerythrine则可以消除PD的上述作用。结论:PD可能通过PKC蛋白信号转导通路对I/R心肌发挥保护作用。     

BDNF对星形胶质细胞的促增殖效应及其ERK信号转导机制

目的探讨BDNF对星形胶质细胞的促增殖作用及其ERK信号转导机制。方法用新生2~3d的SD大鼠,在无菌条件下取脑,制备细胞悬液,以GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞的纯度。取纯化的第2代星形胶质细胞,将细胞分成BDNF组、BDNF加PD98059组和空白对照组,用MTT法检测各组细胞的活性,蛋白印迹检测p-ERK1/2。结果BDNF作用48h后,BDNF组、BDNF加PD98059组和空白对照组的A值分别为0.70±0.06、0.50±0.06、0.54±0.05,BDNF组与BDNF加PD98059组、空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。BDNF组、BDNF加PD98059组p-ERK1的积分光密度(integrated optical density,IOD)与空白对照组的IOD比值分别为(291.22±44.01)%和(102.67±15.50)%(P<0.05);BDNF组、BDNF加PD98059组p-ERK2的IOD与空白对照组p-ERK2的IOD比值分别为(483.57±57.61)%与(123.25±19.83)%(P<0.05)。结论BDNF可诱导星形胶质细胞增殖,促进ERK1/2的磷酸化,其作用可被PD98059所阻断。BDNF对星形胶质细胞的促增殖作用与ERK的信号转导通路有关。