HIF-2α表达对低氧环境下胃癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的探讨抑制缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)表达对人胃癌细胞株BGC823低氧状态下细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法利用氯化钴诱导的人胃癌细胞株BGC823作为研究对象,构建HIF-2α小干扰RNA(siRNA)特异性载体,转染低氧环境下的BGC823细胞,采用RT-PCR和免疫印迹法(Western blot)分别检测转染前后细胞中HIF-2αmRNA和蛋白表达,CCK-8法检测转染前后BGC823细胞增殖情况,流式细胞术检测转染前后BGC823细胞凋亡和细胞周期分布情况。结果低氧诱导下,BGC823细胞HIF-2α表达显著增多。低氧环境下,特异性转染HIF-2αsiRNA于BGC823细胞后,HIF-2αmRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制,细胞增殖能力降低,凋亡率升高,分布于G2期细胞比例升高(P<0.05)。结论低氧环境下BGC823细胞表达HIF-2α增多,通过特异性HIF-2αsiRNA下调低氧环境下BGC823细胞中HIF-2α基因表达,能够抑制BGC823细胞增殖,改变细胞周期分布并诱导其凋亡,为胃癌分子靶向治疗提供新的证据。     

沉默缺氧诱导因子-1α对卵巢癌化疗敏感性的影响

目的观察沉默缺氧诱导因子HIF-1α对卵巢癌细胞化疗敏感性的相关影响并探讨其机理。方法构建HIF-1α基因短发夹RNA真核表达质粒,并转染卵巢癌细胞SKOV3（人卵巢浆液性囊腺癌细胞株）。实验可分为空白组,非特异对照组（转染pNonspecific-siRNA,即SKOV3NS）,目的siRNA组（转染pHIF-siRNA,即SKOV3siRNA）3组,用RT-PCR及Western Blot法分别检测各组HIF-1α基因的mRNA和蛋白的表达水平。细胞经过20μmol/L顺铂作用后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术（FCS）检测细胞凋亡率。结果 SKOV3siRNA转染组HIF-1α基因在mRNA水平和蛋白水平表达均明显降低,SKOV3siRNA组肿瘤细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显增高（P〈0.05）。结论 RNA干扰技术沉默HIF-1α能够有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达,增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

缺氧诱导因子-1α对A549细胞株中生存素表达及其生物学特性的影响

目的观察非小细胞肺癌细胞株A549中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对生存素转录的调控作用及对A549细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测生存素启动子序列与核蛋白结合的情况。EMSA实验分为阴性对照反应组、结合反应组、探针冷竞争反应组、突变探针的冷竞争反应组和特异性抗体反应组。应用脂质体将载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA HIF-1α质粒和阴性(错义链)、内参(β-肌动蛋白)微小RNA(miRNA)质粒转染A549细胞。转染分为未处理组(正常A549细胞)、HIF-1α沉默组(转染HIF-1αmiRNA质粒)、阴性对照组和内参组。杀稻瘟菌素筛选阳性克隆扩大培养;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法筛选出对A549细胞干扰效果最佳的miRNA HIF-1α干扰载体;常氧、缺氧条件下检测各组中HIF-1α、生存素在mRNA和蛋白水平的变化;用细胞计数法、流式细胞术和转移小室迁移试验检测各组细胞增殖、凋亡及迁移细胞数。结果 (1)γ-32P标记的生存素启动子序列-26^-9 bp与A549细胞核蛋白作用,该条带可与HIF-1α抗体结合产生特异性抗体结合条带;(2)常氧下HIF-1α沉默组的HIF-1α和生存素mRNA分别为0.313±0.051和0.060±0.008,明显低于未处理组的1.042±0.036和1.071±0.016(F=436.433,0.002,均P<0.05);HIF-1α和生存素的蛋白含量分别为0.559±0.051和0.051±0.003,未处理组分别是1.452±0.146和0.194±0.007,两组比较差异有统计学意义(F值为53.525和331.646,均P<0.05)。缺氧条件下HIF-1α沉默组中HIF-1α、生存素的mRNA和蛋白分别为0.604±0.040、0.394±0.018、0.997±0.026、0.172±0.006,明显受到抑制(mRNA的t值分别为7.809和-28.936,均P<0.01;蛋白的t值分别为13.523和-14.202,均P<0.01);常氧条件下,转染miRNA后A549细胞增殖(24 h为0.273±0.008)无明显变化,但迁移细胞数(30±6)比未处理组(121±17)减少;缺氧条件下,转染miRNA后,A549细胞生长速度(24 h为0.273±0.008)减慢,细胞体外的迁移细胞数(75±4)减少(均P<0.05)。结论 A549细胞中生存素核心启动子上存在HIF-1α结合位点;miRNA沉默A549细胞HIF-1α表达后,可有效下调生存素基因表达,常氧条件下仅抑制细胞迁移,缺氧条件下不仅促进细胞凋亡,还可抑制细胞增殖和迁移。     

PRL-3基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察短发夹状小干扰RNA（shRNA）沉默PRL-3基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响。方法：构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测转染后MCF-7细胞PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用MTT法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,PRL-3-shRNA组PRL-3基因mRNA和蛋白表达水平明显降低。MTT结果显示MCF-7细胞转染PRL-3-shRNA后细胞增殖水平降低;流式细胞仪检测显示,PRL-3-shRNA转染后,MCF-7细胞凋亡率明显增高。结论：沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进其凋亡。     

Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后的体外实验研究

目的:探讨Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后对MCF-7细胞的影响.方法:利用脂质体将真核表达载体pIRES2-EGFP-Noxa瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞.通过RT-PCR检测转染后mRNA的表达情况.MTT比色法测定细胞增殖的抑制.Hoechst 33342检测细胞的凋亡情况.结果:Noxa基因转染后在乳腺癌MCF-7细胞中成功表达,其转染后24、48、72 h后mRNA表达量逐渐增高.Noxa基因的表达使得乳腺癌MCF-7细胞出现增殖抑制,其24、48、72 h抑制率之间的差异具有显著性(P＜0.05).Hoechst 33342染色显示Noxa基因转染后细胞出现凋亡,其24、48、72 h凋亡率与阴性对照组相比,差异具有显著性(P＜0.05).结论:Noxa基因特染乳腺癌MCF-7细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡.     

MTDH基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨异黏蛋白(MTDH)基因沉默对B淋巴瘤细胞增殖及侵袭能力的影响。方法在B淋巴瘤细胞Raji中转染MTDH siRNA和siRNA对照,分别命名为MTDH siRNA组和siRNA对照组,将没有转染的细胞作为对照组。qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中MTDH表达水平,MTT方法检测细胞增殖和黏附能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力,Western blot检测细胞中波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白水平。结果MTDH siRNA细胞中MTDH mRNA和蛋白水平均明显低于对照组和siRNA对照组(P<0.05)。与对照组和siRNA对照组比较,MTDH siRNA细胞增殖和黏附能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力也降低,细胞中Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTDH基因沉默下调B淋巴瘤细胞增殖能力,抑制B淋巴瘤细胞侵袭和迁移。     

HIF-2α基因与人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的关系

目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默缺氧诱导因子2α（hypoxia inducible factor-2 alpha,HIF2α）基因表达后,人肺腺癌A549细胞株对顺铂耐药性的变化.方法：构建靶向HIF-2α基因的siRNA真核表达载体并转染A549细胞,采用Reαl-time PCR检测HIF-2α mRNA的表达,采用Western blotting检测HIF-2α及多药耐药基因1（multidrug resistance-1,Mdr-1）蛋白的表达,采用MTT法检测顺铂处理后细胞的存活率.结果：在HIF-2α siRNA转染A549细胞后24、48 h后,HIF-2α在mRNA和蛋白水平的表达与空白对照组相比均显著下调（均P＜0.01）,Mdr 1蛋白的表达水平也明显降低（均P＜0.05）.与空白对照组相比,HIF-2α siRNA组细胞对顺铂的敏感性明显增加,各时间点的IC50值均显著降低,差异有统计学意义（均P＜0.01）.结论：靶向HIF-2α的siRNA表达载体能够有效抑制HIF-2α基因的表达,从而逆转A549细胞对顺铂的化疗耐药性.     

靶向沉默c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制

目的探讨抑制c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR及Western blot分别检测膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达;si-c-FLIPs转染人膀胱癌T24细胞,同时转染正常对照组(normal)和阴性对照组(si-control),48 h后Western blot检测c-FLIPs、Cleaved caspase 8、β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)蛋白表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达均显著高于癌旁组织(P0.01)。T24细胞中c-FLIPs基因的表达最高,选择作为研究对象;转染si-c-FLIPs后FLIPs的表达显著降低;si-c-FLIPs组细胞存活率及β-catenin和Cyclin D1蛋白表达显著低于normal组,细胞凋亡率及Cleaved caspase 8蛋白表达显著高于normal组(P0.01)。结论抑制膀胱癌中c-FLIPs基因表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞的凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

纳米介导的缺氧诱导因子1α小干扰RNA抑制人食管鳞癌TE-1细胞生长

背景:纳米微粒作为一种比较理想的非病毒基因递送载体,具有无免疫原性和致瘤性等优越性.利用纳米技术和基因干扰技术阻断缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α)在食管鳞癌组织的表达,降低癌细胞对化疗药物的耐药性,理论上成为能够抑制食管癌细胞生长的有效方法.目的:探讨HIF-1α小干扰RNA纳米微粒对人食管鳞癌TE-1细胞生长的抑制作用.设计、时间及地点:以体外培养的食管鳞癌TE-1细胞为对象,基因水平完全随机对照实验,于2007-01/2008-12在中山大学附属第三医院中心实验室完成.材料:由上海生物工程公司合成HIF-1α小干扰RNA,采用超声乳化法制备纳米微粒.人食管鳞癌TE-1细胞株购自中科院上海细胞库.方法:体外培养的人食管鳞癌TE-1细胞分为4组:分别为生理盐水组,不含基因的纳米微粒组,HIF-1α小干扰RNA组,HIF-1α小干扰RNA纳米微粒组.主要观察指标:RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达,Western-blot法检测HIF-1α蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况.结果:处理72 h后HIF-1α小干扰RNA纳米微粒组细胞的HIF-1αmRNA表达和HIF-1α蛋白表达低于其他3组(P＜0.01),细胞凋亡率高于其他3组(P＜0.01).HIF-1α小干扰RNA纳米微粒组细胞增殖受明显抑制,生长缓慢,与其他3组比较,差异有显著性意义(P＜0.01).结论:HIF-1α小干扰RNA纳米微粒能够有效减少食管鳞癌TE-1细胞的HIF-1αmRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制TE-1细胞的生长.     

IncRNA MT1JP抑制乳腺癌细胞增殖并促进乳腺癌凋亡研究

目的探讨长链非编码RNA金属硫蛋白1J(IncRNA MT1JP)对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响。方法收集人乳腺癌组织及对应的癌旁组织,体外培养乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、HCC1569和人乳腺正常的上皮细胞MCF10A,RT-PCR检测组织和细胞中MT1JP水平。乳腺癌细胞转染MT1JP过表达载体和空载体分别命名为MT1JP组和NC组,同时以只加入转染试剂的细胞为对照组,RT-PCR检测细胞中MT1JP表达水平。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)表达水平。结果 MT1JP在乳腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织(P0.05)。MT1JP表达水平由高到低为:MCF10A、HCC1569、MDA-MB-231、MCF-7,后续选用MCF-7细胞继续研究。MT1JP组细胞存活率及p-Akt水平明显低于对照组,而凋亡率和Cleaved Caspase-3水平明显高于对照组(P0.05)。结论 MT1JP在乳腺癌中表达下调,MT1JP能够抑制乳腺癌细胞增殖,促进乳腺癌细胞凋亡,作用机制可能与Akt信号通路有关。     

低氧诱导因子-1α对肺癌生长影响的研究

目的:研究抑制低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对肺癌细胞体内生长的影响并探讨可能机制。方法:以小RNA干扰(siRNA)表达质粒抑制A549肺癌细胞的HIF-1α表达,建立稳定表达细胞株并接种于裸鼠,观察肿瘤生长情况,TUNEL法检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖。结果:抑制HIF-1α表达可加速肿瘤生长,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的发生,降低糖酵解关键基因的表达。结论:HIF-1α在低氧环境下可能通过上调糖酵解基因表达促进糖酵解,改变细胞生长环境,促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。     

骨髓瘤U266细胞中核干细胞因子NS与程序性细胞死亡配体PD-L1关联性的研究

目的:探讨骨髓瘤U266细胞内Nucleostemin(NS)基因和程序性死亡配体-1(programmed deathligand-1,PD-L1)的关联性以及NS表达下调对骨髓瘤细胞的凋亡影响,评价NS、PD-L1关联性与MM细胞生物学行为改变的关系以及二者联合作为反映MM肿瘤细胞状态标志物的可行性。方法:通过NS-RNAi-GV248重组慢病毒下调U266细胞的NS基因表达;采用real-time PCR检测转染后NS、 PD-L1及相关PI3K/AKT/mTOR通路基因变化;应用Western blot、流式细胞术检测NS及PD-L1蛋白表达;采用Annexin V-APC/7-AAD双染法检测敲除NS基因前后的U266细胞的凋亡变化。结果:在MOI=10条件下,NS-RNAi-GV248重组慢病毒转染U266细胞后,荧光显微镜下观察显示,转染效率达到75%以上;real-time PCR显示,与阴性对照组(1.002±0.026)相比,转染组(0.415±0.089)的NS、PD-L1及PI3K/AKT/mTOR基因的m RNA相对表达量明显减低(P 0.05);流式细胞术和Western blot结果表明,慢病毒转染后PD-L1蛋白表达量明显下调,U266细胞凋亡增加(P 0.05)。结论:骨髓瘤细胞U266中存在NS及PD-L1基因的异常高表达。下调NS基因表达后出现PD-L1基因及相关PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的下调,说明二者引起的细胞生物学改变存在联动效应。     

低氧诱导因子过表达对人外周血内皮祖细胞分化影响的体外研究

为了研究低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）在体外对人外周血内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）向血管内皮细胞（endothelial cells,EC）分化的影响,用密度梯度离心法分离人外周血EPC,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPC,计算转染效率,RT-PCR方法测定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA在质粒转染前后含量变化,免疫细胞化学方法检测在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α质粒转染前后不同时点蛋白表达情况,细胞膜表面抗原决定簇流式细胞术测定FITC-CD31^＋EPCs/EC在未转染组、pEGFP空质粒或HIF-1α质粒转染组转染3-10天后的组间差异,光镜下观察转染前后细胞形态及分化程度.结果表明：EPC获得后经电穿孔转染,质粒转染效率约20%;RT-PCR示HIF-1α mRNA在常氧中有表达,并在HIF-1α过表达组合量增加（P＜0.05）;其下游靶基因VEGF在HIF-1α过表达组表达上调（P＜0.05）;HIF-1β表达在各组中无明显差异（P＞0.05）.免疫组织化学显示常氧下HIF-1α蛋白无表达,转染HIF-1α质粒12小时后HIF-1α蛋白表达阳性,转染24小时后蛋白表达阴性.流式细胞仪检测显示电穿孔转染HIF-1α质粒使CD31＋细胞的百分比增加（P＜0.05）.细胞形态学观察显示：未转染及pEGFP空质粒转染组细胞在培养6天后呈集落样散在分布,培养14天后贴壁细胞部分呈梭样;穿孔转染的HIF-1α质粒组细胞于培养6天后集落周边分化出梭样贴壁细胞,培养14天后呈梭样,或铺路石样牢固贴壁.结论：HIF-1α质粒能有效地用于基因干扰治疗,有助于EPC向EC分化,为体内研究奠定了基础,也为进一步体内诱导血管新生、治疗缺血性心脏病提供了更广阔的治疗选择.     

RNA干扰HIF-2α基因对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制缺氧诱导因子(hyposia-inducible factor 2α,HIF-2α)基因表达对人肺腺癌A549细胞株侵袭转移的影响。方法:构建针对HIF-2α-siRNA并转染A549细胞株,采用实时荧光定量多聚酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot方法检测HIF-2α表达水平,通过Tran-swell试验及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白检测,探讨HIF-2α-siRNA对A549细胞侵袭力的影响。结果:将HIF-2α-siRNA转染A549细胞后,HIF-2α的mRNA和蛋白表达水平均下调。qRT-PCR检测显示,第4号siRNA表达载体抑制作用最强,转染后24 h和48h对HIF-2α基因mRNA表达水平抑制率分别为(60.63±5.10)%和(80.00±3.55)%。Western blot检测同样证实,第4号siRNA表达载体对于HIF-2α蛋白表达抑制作用最强,转染后24 h和48 h抑制率分别为(31.69±11.56)%和(82.87±4.09)%。Transwell试验发现,转染HIF-2α-siRNA后,穿膜细胞数显著减少(P<0.05),表明细胞侵袭力下降。转染HIF-2α-siRNA后,VEGF表达水平显著下调(P<0.01)。结论:转染HIF-2α-siRNA可有效降低A549细胞的侵袭转移力。     

缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对缺氧时视网膜血管内皮细胞增殖活性影响的研究

目的研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸(ASODN)对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞(BREC)增殖活性的影响,探讨HIF-1αASODN治疗视网膜新生血管性疾病的可行性。方法根据Genbank提供的HIF-1αcDNA序列设计HIF-1αASODN,全硫代修饰,并用脂质体包被,体外转染BREC细胞,荧光显微镜下计算转染效率。采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达,采用免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、细胞内ATP含量以分析细胞增殖能力。结果荧光显微镜检测表明,HIF-1αASODN可成功转染BREC。免疫荧光检测显示,未转染组缺氧开始时HIF-1α有极低表达,在缺氧1h时表达量显著上升,4h达到高峰,16h后下降。而ASODN转染组HIF-1α的表达始终在极低水平,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。PCNA免疫组织化学检测和细胞内ATP含量测定结果显示,在缺氧后各检测点ASODN转染组较对照组细胞增殖活性受到抑制,抑制作用在缺氧后8h最为明显(P<0.01)。结论 HIF-1αASODN转染能有效抑制BREC细胞HIF-1α的表达,从而降...     

hTERT基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性及COX-2表达的影响

目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。     

microRNA-206对低氧诱导心肌细胞凋亡的作用及其可能机制

目的探讨microRNA-206(miR-206)在低氧诱导的原代心肌细胞凋亡中的作用及可能的作用机制。方法将心肌细胞分成六组,正常组、低氧组、miR-206模拟物组、miR-206模拟物-NC组、miR-206抑制剂组和miR-206抑制剂-NC组,其中正常组心肌细胞未转染,正常培养,低氧组心肌细胞未转染,经过低氧处理,miR-206模拟物组、miR-206模拟物-NC组心肌细胞经低氧处理后分别转染miR-206模拟物及其阴性对照序列,miR-206抑制剂组和miR-206抑制剂-NC组心肌细胞在低氧处理后分别转染miR-206抑制剂及其阴性对照序列。设置不同低氧处理时间(0 h、12 h、24 h和48 h)处理心肌细胞,同时正常组细胞正常培养,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况,qRT-PCR检测miR-206表达情况,采用流式细胞术、免疫组化检测和Western blot法检测细胞凋亡情况。MTT检测六组心肌细胞增殖变化情况,流式细胞术检测细胞凋亡改变情况,qRT-PCR检测表皮生长因子受体(EGFR)-低氧诱导因子1α(HIF-1α)信号通路mRNA表达情况,Western Blot检测EGFR-HIF-1α信号通路蛋白表达情况。结果 MTT结果显示心肌细胞随低氧处理时间增加增殖呈下降趋势,低氧处理24 h和48 h细胞增殖显著低于正常组(P 0. 05);免疫组化检测结果可知,低氧诱导48 h后,心肌细胞内凋亡蛋白cleaved-caspas3显著增加;流式细胞仪检测结果可知低氧诱导24 h、48 h后细胞凋亡呈时间依赖性增加; Western blot鉴定并证实细胞凋亡相关蛋白表达增加及抗凋亡蛋白表达的下降;心肌细胞随低氧处理时间增加miR-206表达呈上升趋势,处理24 h和48 h的miR-206表达量显著高于正常组(P 0. 05)。miR-206模拟物转染组细胞增殖显著增加,凋亡明显下降,miR-206抑制剂组增殖显著下降,凋亡显著增加(P 0. 05)。qRT-PCR法检测发现干扰后各组EGFR、HIF-1α和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的mRNA水平无变化,但Western blot结果显示miR-206模拟物组较其阴性对照组EGFR和HIF-1α蛋白表达水平降低,而miR-206抑制剂组较其阴性对照组EGFR和HIF-1α蛋白表达水平升高。结论 MiR-206在缺氧的心肌细胞中会异常增高,高表达的miR-206可通过负调控EGFR-IGF-1-HIF-1α信号通路影响心肌细胞的增殖和凋亡。     

Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α诱导的心肌细胞损伤和凋亡中的作用研究

目的 建立心肌细胞炎症损伤模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在心肌细胞损伤和凋亡中的作用。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9c2,用含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞培养基诱导心肌细胞,建立炎症心肌细胞损伤模型。实验包括对照组、炎症组、DDK1不同浓度阻断组共5组。各组检测细胞活力和凋亡率,检测相关基因和蛋白表达;检测细胞培养液中LDH和AST及细胞中SOD浓度。结果 TNF-α诱导H9c2心肌细胞β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著上调,细胞增殖受到抑制、细胞损伤和凋亡增加(P<0.05)。而在DDK1阻断Wnt通路后,相对于炎症组,β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著下调,细胞活力上升、细胞损伤减轻、凋亡率降低(P<0.05)。相关性分析显示,β-catenin基因表达与细胞活力呈负相关,与LDH、AST活性呈正相关(P<0.05)。结论 在TNF-α刺激下,心肌细胞Wnt通路被显著激活,抑制Wnt通路基因表达可减轻细胞损伤和凋亡。     

缺氧诱导因子-1α基因沉默对食管鳞癌细胞体外生长的影响

目的:探讨食管鳞癌细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因与食管鳞癌细胞增殖活力和细胞周期的关系。方法:以RNA干扰方法构建出HIF-1α基因沉默食管鳞癌细胞株,通过Westernblot检测HIF-1α基因在细胞中的表达,通过流式细胞术分析了解HIF-1α基因沉默后细胞周期的变化,通过细胞增殖实验观察HIF-1α基因沉默细胞与对照细胞、模拟缺氧细胞增殖活性的差异。结果:细胞增殖实验发现沉默HIF-1α基因后的Eca-109细胞增殖活力较对照细胞明显低下,为对照细胞的62.6%(0.4768±0.1743vs0.7611±0.2165,P=0.012),流式细胞仪分析表明,HIF-1α基因沉默后的Eca-109细胞与对照细胞相比,G1/G0期细胞明显增加(P<0.05),G2/M期细胞变化不大,S期细胞比例明显减少。结论:核糖核酸干扰HIF-1α的表达后,能抑制鳞癌细胞的增殖活力,并可能阻滞肿瘤细胞周期,抑制HIF-1α的表达,有可能导致肿瘤生长的抑制。