人釉原蛋白基因转染牙周膜细胞的实验研究

目的:构建含有人釉原蛋白(human amelogenin,hAm)基因的慢病毒载体质粒,用重组慢病毒感染人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs),初步探讨釉原蛋白基因修饰种子细胞用于牙周组织工程修复的可行性.方法:采用RT-PCR方法获取hAm编码基因,构建慢病毒载体质粒FUAmW,重组质粒经双酶切及测序鉴定.聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法三质粒共转染293T细胞,获取重组慢病毒FUAmW FUGW,感染hPDLCs,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluoreseene protein,GFP)表达,流式细胞仪flow cvtometer,FCM)检测慢病毒载体转染效率.通过RT-PCR检测hPDLC中hAm基因的表达.结果:测序证实,RT-PCR产物序列与Genebank公布的Am编码序列一致,双酶切证实目的片段插入重组质粒.293T细胞及hPDLCs感染72h后.荧光显微镜下可见绿色荧光.FCM测得GFP感染2种细胞的阳性率分别为69.46%和33.99%.RT-PCR证实重组慢病毒FUAmW感染的细胞能表达hAm基因.结论:成功构建含有人釉原蛋白基因的慢病毒载体质粒,经293T细胞包装.得到重组慢病毒可感染牙周膜细胞.     

人釉原蛋白编码区基因原核表达载体的构建

目的：构建人釉原蛋白（amelogenin,AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。方法：运用TA克隆技术。将AMG基因片断插入质粒pMD18-T,通过BamHⅠ和X幻Ⅰ双酶切后。T4 DNA连接酶连接目的基因AMG与原核表达质粒pGEX-4T—1,最终获得重组原核表达载体pGEX-4T—1/AMG。结果：对重组质粒pMD 18-T／AMG和pGEX-4T-1,AMG进行酶切和测序鉴定,酶切电泳图和测序结果与预期结果一致。结论：成功构建了人釉原蛋白（AMG）成熟肽编码区基因的原核表达载体。     

猪牙胚釉原蛋白成熟肽基因原核表达克隆的构建

目的克隆猪釉原蛋白（pAm）成熟肽编码区基因片段，并构建含有该基因的重组原核表达质粒，为制备基因工程化的重组pAm奠定基础。方法从新生小猪牙胚组织中抽提总RNA，逆转录合成牙胚cDNA，通过PCR扩增pAm成熟肽编码序列（约540bp），所得目的基因插入表达载体质粒PGEX4T1，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果重组质粒PGEX4T1-pAm经双酶切和测序鉴定证实载体质粒PGEX4T1中插入的基因片段与pAm成熟肽基因序列完全相同。结论从发育期猪牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列可成功构建含有pAm成熟肽基因的重组表达质粒。     

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。     

通过真核细胞表达系统获得重组人釉原蛋白

目的构建重组人釉原蛋白基因的真核表达系统，并建立稳定表达该蛋白的细胞系。方法取26周龄引产胎儿的牙胚组织，提取总RNA，用RT—PCR技术扩增釉原蛋白基因片段，插入中间表达载体pGEM -T。经双酶切后，再与真核表达载体pcDNA3.1^TM／myc—His（-）B相连接，构成最终的表达质粒，将该重组表达质粒转染至HEK 293A细胞，用G418筛选出阳性细胞克隆，并建立稳定表达釉原蛋白的细胞系。结果通过测序表明，人釉原蛋白基因被成功地连接到了真核表达载体上。将该表达系统转染HEK293A细胞后，进行Western Blot检测，证明有相对分子质量约32000的釉原蛋白表达。结论本实验成功构建了重组人釉原蛋白真核表达系统，建立了稳定细胞系，为获得高纯度的釉蛋白，进一步研究蛋白质功能奠定了基础。     

PERK干扰慢病毒载体的构建及其在人牙髓细胞中的表达

目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63％.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件.     

釉成熟蛋白真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建釉成熟蛋白真核表达载体peDNA3.1-Amelotin,并观察其在293T细胞中的表达情况.方法:以出生后6d的昆明小鼠下颌磨牙中提取的总RNA为模板,设计合成特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠的釉成熟蛋白[Amelotin(GenelD:71421)],包括编码区全长在内的部分cDNA序列,克隆到pMD18-T克隆载体,酶切鉴定正确;然后亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定及测序正确.将构建的重组载体磷酸钙法转染293T细胞,检测Amelotin的表达情况.结果:成功克隆了Arnelotin基因编码区全长序列;构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,磷酸钙法转染后可检测到Amelotin基因在293T细胞中的表达.结论:构建了重组pcDNA3.1-Amelotin真核表达载体,并成功表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性奠定了基础.     

人釉原蛋白成熟肽基因的原核表达和纯化

目的 建立人釉原蛋白(amelogenin,AMG)成熟肽基因原核表达和纯化的技术路线,获得纯化的人AMG成熟肽蛋白,以期为牙周炎的基础治疗提供依据.方法 通过已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1-AMG,转化BL21大肠杆菌,原核表达后利用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白纯化系统(glutathione S-transferase fusion protein purification system,GSTrapFF)亲和层析柱进行重组人AMG的纯化.结果 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图和蛋白质印迹法分析结果显示,获得纯化的相对分子质量为45 000大小GST-AMG融合蛋白和19 000大小的目的 蛋白AMG.结论 利用pGEX-4T-1-AMG-BL21体系成功获得了人AMG成熟肽基因在大肠杆菌中的原核表达和纯化.     

人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列（shRNA1~3）,通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90％以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。     

靶向人CD106基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：：构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法：设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论：成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。     

HDAC8过表达慢病毒载体构建、转染及表达的研究

目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase 8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察HDAC8的表达。方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC-FU-HDAC8。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况。结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体。大鼠BMSCs转染后HDAC8 mRNA及蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达。     

生长分化因子15基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）基因过表达慢病毒载体。 方法 根据GDF15 mRNA的基因序列,合成GDF15基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞,再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞,包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T细胞,再用Western blot检测GDF15的表达情况。 结果 测序结果证实GDF15 基因正确插入载体中。慢病毒转染293T细胞后,GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。 结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功,并有效增强GDF15基因在293T细胞中的表达。     

BimS慢病毒RNA干扰载体的构建及其感染效率和干扰效果的实验研究

目的:应用RNA干扰技术构建BimS慢病毒RNA干扰载体,探讨其感染效率和干扰效果.方法:针对人BimS设计3个干扰靶点,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切线性化载体中.将重组质粒进行病毒包装、并且通过感染ACC-2细胞观察其感染效率,定量PCR检测其对BimS mRNA干扰效果.结果:PCR产物经扩增电泳后阳性克隆得到337bp条带,插入序列片段与DNA测序结果完全相符.重组慢病毒载体在293T细胞中包装获得滴度为2×10s TU/ml的病毒颗粒,MOI=20,转染效率为85％.转染pFU-GV-BmS-1组、pFU-GV-BmS-2组及对照组BmS mRNA相对表达水平分别为:0.743±0.025、0.466±0.023、1.266±0.042(组间两两比较,P＜0.05).结论:BimS慢病毒RNA干扰载体构建成功,并能高效感染ACC-2细胞及下调BmS mRNA表达.     

人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建

目的　构建人釉原蛋白(AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG。方法　采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和Xhol I行双酶切,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A,构建重组质粒PsecTaq2A-AMG,并对重组质粒进行鉴定。结果　①PCR扩增产物经1·5%琼脂糖凝胶电泳,可见大小约519 bp的特异性条带,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A-AMG酶谱分析与预期结果一致,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论　用此方法可成功构建AMG 编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG。