普伐他汀抑制肿瘤坏死因子α介导的人脐动脉血管平滑肌细胞成骨样钙化

目的 研究普伐他汀干预对肿瘤坏死因子α（TNF-α）介导的人脐动脉血管平滑肌细胞（hUASMC）成骨样分化标志蛋白骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP-2）表达以及细胞外钙盐沉积的影响，并探讨普伐他汀在血管钙化防治中的潜在作用。 方法 植块贴壁法原代培养人hUASMC。予以TNF-α刺激和普伐他汀干预，甲O-酚酞络合酮方法测定细胞外基质钙盐沉积；实时定量PCR法观察血管平滑肌细胞BAP和OPN mRNA表达水平；免疫印迹法观察血管平滑肌细胞BAP、OPN和BMP-2蛋白表达水平。 结果一定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式抑制TNF-α对hUASMC的促增殖作用（r = －0.946，P < 0.01）；一定浓度范围的普伐他汀呈浓度依赖方式下调TNF-α介导上调的BAP、OPN mRNA表达（r = －0.972，P < 0.01）与蛋白的表达水平（BAP蛋白，r = －0.820，P < 0.01；OPN蛋白，r = －0.972，P < 0.01；BMP-2蛋白，r = －0.928，P < 0.01），抑制血管平滑肌细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积（r = －0.973，P < 0.01）。 结论 普伐他汀可抑制TNF-α对hUASMC的促增殖作用，抑制细胞成骨样分化，减少细胞外基质钙盐的沉积。     

白细胞介素6对体外培养人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化、钙化的影响

目的 研究白细胞介素6（IL-6）对体外培养人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样转化、钙化的作用及可能的信号通路。 方法 组织植块法原代培养HUASMC。培养基加入不同浓度重组人IL-6（rhIL-6）孵育细胞,设空白对照组。茜素红S钙沉积染色及甲氧-酚酞络合酮法检测细胞层钙盐含量。实时定量PCR、荧光定量法以及Western印迹法分别检测骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）、骨形成蛋白2（BMP２）和骨保护素（OPG）基因以及蛋白表达。凝胶迁移滞后实验（EMSA）检测核心结合因子α1亚基（Cbfα1）的结合活力,以及分别应用p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂SB203580和蛋白激酶C二氢神经鞘氨醇（DHC）后Cbfα1的结合活力。 结果 rhIL-6 50 μg/L诱导12 d,细胞基质层茜素红S染色阳性。与对照组相比,细胞层钙盐含量在rhIL-6 10 μg/L组刺激9 d[（0.76±0.02） mmol/g蛋白]和12 d[（1.54±0.11） mmol/g蛋白]升高,50 μg/L组刺激6 d[（1.81±0.03） mmol/g蛋白]、9 d[（2.08±0.10） mmol/g蛋白]和12 d[（3.22±0.18） mmol/g蛋白]升高,并呈时间、剂量依赖地增加。rhIL-6 10 μg/L刺激12 h,BMP2 mRNA（3.04±0.07）和蛋白（8.14±0.41）及BAP mRNA（2.51±0.11）和蛋白（3.96±0.54）表达上调;刺激72 h,OPN mRNA（3.14±0.32）和蛋白（2.57±0.43）水平及OPG mRNA（4.06±0.24）和蛋白（3.46±0.34）水平上调。rhIL-6刺激6 h,Cbfα1结合活力增加;DHC能够部分抑制rhIL-6诱导的Cbfα1结合活力增加,SB203580没有明显作用。 结论 IL-6体外能够诱导HUASMC发生钙化和成骨样转分化,这可能是临床观察到IL-6与血管钙化相关的机制之一。IL-6的这一作用可能与细胞内蛋白激酶C通路的活化有关。     

尿毒症血清诱导人脐动脉平滑肌细胞成骨样转化和钙化的研究

目的 研究尿毒症血清对原代培养人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）成骨样转化和细胞外基质钙沉积的影响。 方法 收集40例健康人、40例非透析尿毒症患者和45例透析尿毒症患者血清，检测有关生化指标。组织植块法原代培养HUASMC，分别给予健康人血清（对照组）、透析（透析组）和非透析（非透析组）尿毒症血清孵育。茜素红S钙沉积染色及甲氧-酚酞络合酮法检测细胞层钙盐含量。实时定量PCR、荧光定量法及Western 印迹分别检测骨特异性碱性磷酸酶（BAP）、骨桥蛋白（OPN）和骨形成蛋白2（BMP２）基因以及蛋白表达。 结果 血清生化检测结果显示尿毒症血清较健康对照存在高磷、高脂、高全段甲状旁腺激素（iPTH）、高C反应蛋白（CRP）、白细胞介素6（IL-6）和低胎球蛋白A（P < 0.05），而透析组血清的三酰甘油、CRP、IL-6较非透析组血清高（P < 0.05）。与健康对照组相比，透析组和非透析组尿毒症血清均使HUASMC钙盐沉积更显著，BAP、OPN以及BMP2的表达上调（P < 0.05），且透析组血清作用更明显。 结论 尿毒症血清体外能够诱导HUASMC成骨样转化和钙化，提示可能和尿毒症相关的血管钙化有关。透析并发的微炎性反应状态可能加速了这一过程。     

Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制

目的从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚(IS)诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),以IS按0、200、500、1 000μmol/L的浓度梯度干预6 d,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time聚合酶链式反应(PCR)和Western印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α(α-SMA)、smoothin、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核结合因子α1(Cbfα1)、Klotho和不同DNA甲基化转移酶(DNMT)的m RNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率;在IS 1 000μmol/L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷(5Aza-2dc)进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验,组间率的比较采用卡方检验。结果IS 1 000μmol/L组HASMC细胞外基质呈红色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的α-SMAm RNA和蛋白及smoothin表达水平,上调OPN、ALP的m RNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较,IS 200、500、1 000μmol/L刺激6 d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率(9±1%与4±0.7%,t=5.38,P0.01;18±1.3与4±0.7%,t=6.92,P0.01;41±2%与4±0.7%,t=9.26,P0.001)。IS 500、1 000μmol/L可显著下调HASMC的Klotho m RNA和蛋白表达水平。同时IS 1 000μmol/L可显著上调HASMC的DNMT1 m RNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc 10μmol/L干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积,上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调Cbfα1蛋白表达水平,同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率(20±1%与41±2%,t=6.98,P0.01)、上调HASMC的Klotho蛋白表达水平。结论 IS可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达,启动Klotho基因超甲基化,进而下调Klotho基因转录和表达,诱导血管平滑肌细胞成骨转化。     

肿瘤坏死因子-α和骨形态发生蛋白-2诱导成纤维细胞表达成骨表型的协同作用机制

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导成纤维细胞表达成骨表型的可能机制。方法:分离、纯化人真皮成纤维细胞,使其生长在分别含一定浓度的TNF-α、BMP-2和TNF-α与BMP-2联合培养液的干预条件下,采用MTT和RT-PCR技术,检测成纤维细胞增殖和C-myc、BMP-2、BMP-4mRNA表达状况的变化。结果:单独应用TNF-α和联合应用TNF-α与BMP-2可刺激成纤维细胞增殖;TNF-α诱导成纤维细胞表达C-myc mRNA和BMP-2 mRNA;TNF-α与BMP-2联合应用可诱导成纤维细胞表达BMP-4 mRNA。结论:TNF-α可诱导成纤维细胞转化,并赋予其新的生物特征;外源性BMP-2和内源性BMP-2、BMP-4的协同效应是成纤维细胞表达成骨表型的机制之一。     

诱导立体网架上成纤维细胞表达成骨表型及其机制的研究

目的探讨诱导条件下的成纤维细胞在三维结构的聚乙醇酸（PGA）网架上表达成骨表型的可行性,以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）对成纤维细胞骨形态发生蛋白（BMP）受体表型表达的影响。方法分离、纯化人皮肤成纤维细胞,实验用第2代细胞：（1）种植成纤维细胞于PGA网架上,进行体外旋转培养,并用含TNF-α（50U／ml）和BMP-2（0．1μg／ml）的条件培养液进行诱导。于1d,3、6周后利用倒置相差显微镜、扫描电镜、四环素荧光标记、茜素红染色方法观察细胞生长、骨样组织形成和矿化物沉积情况。上清液生化检测分析成骨性标志物分泌情况;（2）接种成纤维细胞于预置玻片或75cm。培养瓶中,用含TNF-α（50U／ml）的条件培养液进行一次性或连续性干预,采用逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学技术,于2．4、6、8d后分别检测BMPⅠ型受体（BMPR-ⅠA和BMPR-ⅠB）mRNA表达及蛋白形成状况。结果诱导3周后三维网架上的成纤维细胞表达成骨表型,分泌成骨细胞特征性标志物：骨钙素（OCN）和骨特异性碱性磷酸酶（B-AKP）;分泌大量细胞外基质形成骨样组织;平面培养发现,TNF-α（50U／ml）连续干预8d可增高BMPR-ⅠB的mRNA表达和蛋白合成。结论三维立体网架上的成纤维细胞在诱导条件下能够向成骨型细胞转化,形成骨样组织,有希望作为一种新的成骨型细胞的种子细胞源;TNF-α为BMP-2的靶向作用提供条件,TNF-α和BMP-2联合应用是调节成纤维细胞表型转化的诱导条件之一。     

高磷对血管平滑肌细胞骨钙素mRNA表达和钙沉积的影响

目的 观察高磷对培养的牛主动脉平滑肌细胞骨钙素(OC)mRNA表达和钙沉积的影响,探讨高磷是否为促进血管钙化的独立因素。方法 用不同磷浓度[正常组(Pi 1.5 mmol/L)、高磷组(2.0 mmol/L)]的培养液,培养牛主动脉平滑肌细胞,观察72 h骨钙素的表达,以及不同时间(第3、6、9天)血管平滑肌细胞的钙沉积。上清液中骨钙素浓度用放射免疫法测定。RT-PCR观察骨钙素mRNA的表达。平滑肌细胞钙含量用甲O-酚酞络合酮方法测定。BCA法测定蛋白含量,用蛋白含量标化骨钙素浓度和钙含量。结果 3d后与正常磷组相比,高磷组上清液骨钙素水平明显增高[高磷组(15.03±2.60)pg/μg蛋白比正常磷组(2.98±0.84)pg/μg蛋白,P<0.001];高磷组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也显著增加(OC/GAPDH:1.91±0.13比0.75±0.04,P<0.001)。高磷组钙沉积显著增加[培养第6天,高磷组(77.19±11.69)μg/mg蛋白比正常磷组(25.77±1.75)μg/mg蛋白,P<0.01],呈时间和剂量依赖性。von Kossa钙染色,高磷组平滑肌细胞中见大量的黑色颗粒沉积。结论 高磷可直接刺激平滑肌细胞的钙沉积和骨钙素产生增加,促进血管平滑肌细胞钙化。高磷血症是促发血管钙化的独立因素。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

慢性肾脏病5期患者桡动脉gremlin表达与血管钙化的关系

目的 探讨慢性肾脏病（CKD）5期患者桡动脉中骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂gremlin表达与血管钙化的关系。 方法 40例CKD5期患者为试验组,于行首次动静脉内瘘术时取桡动脉标本;38例单纯外伤性脾破裂患者为对照组,取其脾小梁动脉标本。用钙盐特异性染色法（von Kossa）对动脉进行钙化染色;用免疫组化法检测动脉gremlin、BMP-2、-7的表达,并用ELISA法检测血清中3者浓度;用病理图像分析系统（IPP6.0）对组织切片进行半定量化图像分析;用SPSS 19.0统计分析软件进行数据处理。 结果 试验组12例（30%）钙盐染色显著阳性,位于中膜的平滑肌细胞层,而对照组无显著钙盐染色。试验组钙盐染色显著阳性的桡动脉均有gremlin、BMP-2显著表达,位于中膜的平滑肌细胞层,且2者的表达量与钙盐染色程度均呈正相关。试验组BMP-7的表达量显著低于对照组。 结论 gremlin、BMP-2均可能参与了CKD5期患者桡动脉平滑肌细胞向成骨样细胞表型转化这一过程,而BMP-7可能阻止此过程的进展。     

体外高磷环境下血管平滑肌细胞转分化过程的研究

目的 观察体外高磷培养条件下,血管平滑肌细胞（VSMC）向类似成骨样细胞转分化的动态变化特点。 方法 Western印迹和免疫荧光法观察不同磷浓度（1.0、2.5、3.5 mmol/L）培养条件下,人VSMC的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及成骨细胞特异性的核转录因子Cbfα1、相关骨基质蛋白（骨桥蛋白、I型胶原和骨钙素）的动态变化过程。实时荧光定量PCR法分析上述指标的基因表达水平。在此基础上,以硝酸银染色和茜素红染色了解细胞的钙盐沉积状况,最后通过电镜观察不同培养条件下细胞超微结构的改变。 结果 在无血清的培养条件下,高磷（2.5、3.5 mmol/L）刺激细胞12 h时,胞内 Cbfα1的表达就明显增加（P ＜ 0.05）;3 d后高磷组（2.5、3.5 mmol/L）细胞中I型胶原和骨桥蛋白的含量显著上调（均P ＜ 0.05）;第6天骨钙素的产生开始增加;15 d时高磷组（2.5、3.5 mmol/L）α-SMA的含量才显著下降（P ＜ 0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,高磷环境培养1 d时,细胞中骨桥蛋白、I型胶原的mRNA水平显著升高（均P ＜ 0.05）;5 d时骨钙素的mRNA表达显著增加（P ＜ 0.05）;10 d时α-SMA的mRNA含量显著减少（P ＜ 0.05）。在高磷营养液中培养15 d时,细胞出现多处斑片状的钙盐沉积。电镜可见胞质内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡。 结论 高磷可诱导VSMC向类似成骨样细胞转分化,这是一个复杂的、有多个环节、有序的动态变化过程。     

骨桥蛋白小干涉RNA抑制大隐静脉平滑肌细胞增殖和迁移能力的研究

目的观察骨桥蛋白（OPN）小干涉RNA（siRNA）对大隐静脉血管平滑肌细胞增殖和迁移能力的影响，并探讨可能机制。方法原代培养大隐静脉平滑肌细胞，转染siRNA，用实时定量聚合酶链反应（PCR）和免疫印迹法检测OPN以明确干涉效果，用噻唑蓝比色法（MTT）试验和Transwell法观察对增殖和迁移能力的影响，并用免疫印迹法检测基质金属蛋白酶（MMPs）表达情况。结果OPNsiRNA有效干涉了血管平滑肌细胞OPN的表达，抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力，并减低了基质金属蛋白酶-2、-9（MMP-2、MMP-9）蛋白的表达。结论OPN通过调控MMP-2、MMP-9表达，对大隐静脉平滑肌细胞的增殖和迁移具有重要意义；骨桥蛋白siRNA在细胞水平上能改变血管平滑肌细胞的生物学行为。     

尿毒症血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞的钙化作用

目的 探讨尿毒症患者血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化的影响.方法 尿毒症患者血清在37℃下孵育3d,超速离心法从尿毒症血清中分离磷酸钙晶体和无晶体血清,采用扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪分析晶体的形态及化学特征.体外培养HASMCs,分为以下4组:对照组、尿毒症血清组、磷酸钙晶体组和无晶体血清组.茜素红染色及甲氧酚酞络合酮法检测HASMCs钙化结节的形成及细胞内钙含量.实时荧光定量PCR法检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、核结合因子α1亚基(Cbfα1)、碱性磷酸酶(ALP)、基质γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)的mRNA表达.Cbfα1、OPN和BMP-2的蛋白表达用Westcrn印迹和ELISA法检测.结果 尿毒症血清可诱导磷酸钙晶体形成.与对照组相比,尿毒症血清明显促进HASMCs钙化结节形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),并上调细胞BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜ 0.01);而磷酸钙晶体亦促进HASMCs钙化结节的形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),上调BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜0.01).无晶体血清组的HASMCs胞内钙含量和上述成骨蛋白的表达与对照组差异无统计学意义(均P＞ 0.05).结论 尿毒症血清可能通过诱导磷酸钙晶体的形成促进血管钙化的发生.     

骨形态发生蛋白7抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化

慢性肾脏病(CKD)患者高磷血症可诱导血管平滑肌细胞(VSMC)向成骨样细胞转分化,是血管钙化发生的关键起始环节.骨形态发生蛋白7(BMP-7)是维持多种组织器官正常发育分化成熟的因子.本研究观察BMP-7对高磷诱导的VSMC成骨样分化及钙盐沉积的影响,以期探讨BMP-7是否具有预防血管钙化发生的作用.     

可溶性酪氨酸激酶2融合蛋白对肿瘤坏死因子α诱导腹膜血管内皮细胞新生血管能力的影响

目的观察可溶性酪氨酸激酶2融合蛋白（sTie-2-Fc）对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导腹膜血管内皮细胞新生血管能力的影响，及探讨TNF-α促进血管新生的机制。方法观察原代培养的人腹膜微血管内皮细胞经TNF-α作用后在基底膜基质（Matrigel）上形成管状结构的能力；在transwell板上迁移能力；对异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）通透性的改变；以及用sTie-2-Fc干预后细胞上述功能的改变。结果TNF-α组与对照组相比，内皮细胞形成管状结构数显著增多[（70±7）个，4个视野比（17±4）个，4个视野，P〈0．05]；TNF-α＋sTie-2-Fc组[（40±6）个，4个视野]比TNF-α组管状结构数显著减少（P〈0．05）；sTie-2／Fc组和对照组间细胞管状结构数差异无统计学意义。TNF-α促进内皮细胞迁移能力可被sTie-2-Fc拮抗[（198±12）个／HP比（76±11）个／HP，P〈0．05]。对照组和sTie-2-Fc组间通透性差异无统计学意义；与对照组和sTie-2-Fc组比较，TNF-α组和TNF-α＋sTie-2-Fc组细胞通透性显著增加（P〈0．05），但两组间细胞通透性差异也无统计学意义。结论TNF-α促进腹膜血管新生与血管生成素及其受体有关。     

细菌性腹膜炎诱导大鼠多器官功能不全综合征后结肠运动的变化和机理

目的探讨细菌性腹膜炎致多器官功能不全综合征（MODS）大鼠结肠运动的变化和细胞因子白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及诱生性一氧化氮合成酶（iNOs）对结肠运动的影响。方法将Wistar大鼠随机分成正常对照组和MODS组；分别观测2组大鼠排便的粪点数、结肠肌条的振幅、结肠平滑肌细胞长度以及血清一氧化氮（NO）的变化；利用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测结肠平滑肌IL-6、TNF-α和iNOS表达的变化。结果MODS组排便的粪点数和肌条的振幅均明显低于正常对照组（P〈0．05）；IL-6、TNF-α和iNOS蛋白表达在正常对照组为阴性表达，在MODS组为阳性表达；在正常对照组未检出IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和iNOS mRNA的表达，而在MODS组，IL-6 mRNA、TNF-α mRNA和iNOS mRNA均呈阳性表达；MODS组平滑肌细胞的长度和血清NO水平均较正常对照组明显增高（P〈0．01）。结论MODS后结肠运动功能障碍与iNOS、IL-6和TNF-α密切相关。     

糖尿病大鼠肾小动脉内膜中膜厚度比与骨基质蛋白的相关性

目的 观察糖尿病大鼠肾小动脉骨基质蛋白表达情况及内膜中膜厚度比变化，探讨其相关关系及对糖尿病肾病血管病变的影响。 方法 70只健康雄性SD大鼠被随机分为糖尿病肾病组（DN，n = 40）和健康对照组(N，n = 30)。DN大鼠模型采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射诱导，成功35只。N组予同等剂量柠檬酸缓冲液。分别于4、12、24周处死动物，应用免疫组化方法检测各时间点肾小动脉中骨基质蛋白核心结合因子（Cbfα1）、骨形态蛋白2（BMP-2）的表达。原位杂交法检测其基因表达。应用免疫荧光方法检测肾小动脉内膜中膜厚度比。实时荧光定量PCR法测定BMP-2及基质Gla蛋白（MGP）的基因表达。 结果 DN组各时间点血糖及尿蛋白量(24 h)均较N组显著增高（P < 0.05），自第12周开始，DN组血肌酐、血磷较N组显著增高（P < 0.05）。免疫组化显示DN组肾小动脉4周时已有Cbfα1、BMP-2表达，随时间延长表达逐渐增强，24周表达最强，各时间点均显著高于N组（P < 0.05）。原位杂交显示Cbfα1、BMP-2仅在肾小动脉中有表达，表达趋势同免疫组化结果；4周时主要表达于血管内弹力层；12周后外弹力层及肌层表达也增强。实时荧光定量PCR显示DN组4周时BMP-2 mRNA已有表达，随时间延长表达逐渐升高，24周最高（P < 0.05）； DN组MGP表达量 4周最高，随时间延长表达逐渐降低，24周最低（P < 0.05）。而N组BMP-2和MGP mRNA各时间点表达量差异均无统计学意义。免疫荧光显示第4、12周时，DN组内膜中膜厚度比与N组差异均无统计学意义；24周时显著高于N组（P < 0.05）。DN组Cbfα1与BMP-2呈正相关（r = 0.670, P < 0.01）；与MGP呈负相关（r = －0.466，P < 0.05）；小动脉内膜中膜厚度比与Cbfα1、BMP-2呈正相关（r = 0.727，P < 0.01； r = 0.581，P < 0.01）。 结论 DN早期小动脉内膜中膜厚度比与Cbfα1、BMP-2呈正相关。Cbfα1、BMP-2、MGP可能参与了DN血管病变。     

炎性环境中小白菊内酯对肌腱干细胞成骨分化的影响

[目的]观察炎性环境下小白菊内酯(PAR)对肌腱干细胞成骨分化的作用,探索其对骨肌腱接点损伤修复的作用及其信号通路。[方法]利用胶原酶法结合低密度接种法分离肌腱干细胞,体外验证分离细胞的成骨、成脂分化能力;TNF-α构建的炎性环境下,设置不同浓度组小白菊内酯(PAR)刺激人肌腱干细胞,用qRT-PCR检测炎症相关基因以及肌腱、成骨相关基因的表达,及Western Blot检测Run x2、β-catenin蛋白的表达以检测相关细胞信号通路。[结果]成功从人肌腱组织分离培养出干细胞。qRT-PCR检测显示,100 ng/ml TNF-α可引发炎症反应,PAR能抑制炎性相关基因COX-2、HIF-2α的表达,促进了成骨相关基因Run x2、OPN的表达,与TNF-α组对比差异有统计学意义(P0.05);而肌腱相关基因Col I、Scleraxis的表达较复杂,与TNF-α组相比,下调了Col 1α水平,却上调Scleraxis水平。Western Blot检测结果显示,与TNF-α组对比,PAR显著增加蛋白Run x2、β-catenin的表达(P0.05)。肌腱干细胞在体外可被诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化。镜下观察茜素红S染色,PAR组均有红色钙盐沉积,相比之下对照组及TNF-α组基本无或出现少量钙盐沉积。[结论]炎性环境下小白菊内酯能控制TNF-α引起的炎性反应并可能通过β-catenin信号通路促进肌腱干细胞的成骨分化。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究

目的应用血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growthfactor BB,PDGF-BB）,体外诱导人骨髓间充质干细胞（human bone marrowmesenchymal stemcells,hBMSCs）向血管平滑肌细胞表型分化,探讨该方法的可行性及诱导细胞作为组织工程血管平滑肌种子细胞的可行性。方法抽取健康成人志愿者骨髓,经密度梯度离心分离得单个核细胞,PDGF-BB（20ng/ml）诱导hBMSCs向血管平滑肌样细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）分化,观察细胞形态变化。免疫荧光检测细胞内血管平滑肌肌动蛋白α（vascular smooth muscleα-actin,SMα-actin）,血管平滑肌钙结合蛋白（vascular smoothmuscle calponin,SMcalponin）,血管平滑肌肌球蛋白重链（vascular smooth muscle myosin heavy chain,SMMHC）和细胞血管平滑肌钙结合相关蛋白（smooth muscle22α,SM22α）表达情况;反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测诱导后血管平滑肌细胞SMα-actin,SMcalponin,SMMHC和SM22α的mRNA表达。Western印记检测SM22α的表达。流式细胞分析技术（fluorescence activated cell sorter,FACS）分析诱导后细胞内SMα-actin,SMcalponin,SMMHC的表达。结果PDGF-BB20ng/ml诱导后可见单层培养的细胞形态呈“成纤维细胞样”。免疫荧光检测示SMα-actin,SMcalponin,SMMHC,SM22α表达阳性;RT-PCR检测SMα-actin,SMcalponin,SMMHC,SM22α的mRNA阳性表达。Western印迹检测SM22α的表达为阳性。FACS分析表明诱导后,SMα-actin,SMcalponin,SMMHC表达均增高,与未诱导组比较差异有统计学意义（P〈0.05,n=3）。结论人骨髓间充质干细胞在PDGF-BB的诱导下可向血管平滑肌细胞表型分化,有望成为血管组织工程血管平滑肌种子细胞的来源。     

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的 探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法 不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果 不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB...