TGF-β诱导人肝癌细胞系凋亡信号转导机理的研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肝癌细胞系凋亡及其与β53基因及Smad4的关系。方法选用3种含有不同β53基因状态的人肝癌细胞系，均分为TGF-β1诱导组（实验组）和对照组；应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）对TGF-β1诱导的肝癌细胞的凋亡进行定量检测；另外，应用Lipofectamine 2000把含有Smad4结合元件和荧光素酶基因的TGF—β1可诱导的荧光素酶报告质粒对细胞进行转染，再经TGF-β1作用，分别检测其相对荧光素酶活性。结果在应用TUNEL检测的3个细胞系中，TGF—β1能诱导HepG2细胞（野生型β53）凋亡，其细胞凋亡率实验组明显高于对照组（P〈0．05）；而Huh-7（突变型β53）和Hep3B细胞（缺失型β53）凋亡细胞较少，其细胞凋亡率实验组与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。荧光素酶检测提示，HepG2细胞的Smad4表达活性实验组明显高于对照组（P〈0．05）；而Huh-7和HepB细胞的Smad4表达较低，实验组与对照组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Hep2细胞系比Huh-7和HepB细胞系更易发生TGF-β1诱导的凋亡．Smad4是TGF-β1信号转导途径的主要调控因子之一。     

二十碳五烯酸对三种肝癌细胞系作用的实验研究

目的 探讨二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA)对3种肝癌细胞系作用。方法 EPA作用于HepG2（携带有野生型p53基因）、Huh7（携带有突变型p53基因）和Hep3B(p53基因缺失）这3种肝癌细胞系,通过细胞计数、DNA电泳、流式细胞技术和末端转移酶标记技术等来检测EPA对这3种细胞系的作用和可能的机制。结果 EPA主要是通过诱导HepG2肝癌细胞系的细胞凋亡来抑制其生长,而且这种抑制作用呈现出时间和剂量依赖的关系。而且同时发现EPA对于Huh7和Hep3B这两种肝癌细胞系无明显抑制作用。结论 细胞凋亡的诱导可能是EPA抑制HepG2肝癌细胞系生长的主要机制。而且p53基因可能参与EPA诱导HepG2细胞系细胞凋亡的过程。     

山药多糖通过miR-98-5p/TGFβR1分子轴调控肝癌细胞凋亡的机制研究

目的探究山药多糖(CYPS)通过miR-98-5p/TGFβR1分子轴调控肝癌(HCC)细胞凋亡的分子机制。方法qPCR检测miR-98-5p在不同HCC细胞系中的表达情况,使用不同浓度的CYPS处理Huh-7细胞,CCK-8检测细胞增殖活力,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测TGFβR1和细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax的表达,双荧光素酶报告基因系统验证miR-98-5p与TGFβR1的靶向关系。结果与人正常肝细胞HL-7702相比,miR-98-5p在HCC细胞系中表达升高(均P<0.05),且在Huh-7细胞中的表达高于其他HCC细胞(P<0.05);CYPS处理可明显抑制Huh-7细胞的增殖活力并诱导细胞凋亡(均P<0.05),且10-3 kg/L CYPS对细胞增殖活力的抑制作用比其他浓度明显。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-98-5p靶向调控TGFβ1。与10-3 kg/L CYPS组相比,miR-98-5p mimics可下调10-3 kg/L CYPS对细胞增殖活力(P<0.05)的抑制作用和对细胞凋亡(P<0.01)的促进作用,CYPS+miR-98-5p mimics+pcDNA-TGFβR1组中细胞增殖活力与CYPS+miR-98-5p mimics组相比明显降低(P<0.05),细胞凋亡水平明显升高(P<0.01)。结论CYPS可下调miR-98-5p,促进TGFβR1的表达,抑制Huh-7细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

GADD45β基因表达诱导对不同p53状态的肝癌细胞作用

目的：体外合成GADD45β基因全序列表达质粒后，研究GADD45β基因表达诱导对呈不同p53状态的肝癌细胞的作用及可能机制。方法：采用RT-PCR法获得GADD45β基因全序列，插入pDrive穿梭克隆载体和pIRES2-EGFP荧光表达载体后大量扩增获得DNA，结合p53全基因表达质粒pp53-EGFP转染HepG2、Hep3B细胞后，以[^3H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(^3H—Tdr)和细胞克隆形成法分析DNA合成变化及细胞生长能力；以双抗体夹心ELISA法测定TGF-β1表达变化。结果：成功合成GADD45β基因全序列和表达质粒，通过流式细胞仪收集转染阳性的荧光表达细胞能显著提高转染效率；转染GADD45β后．具有野生型p53基因的HepG2细胞的细胞克隆形成能力和DNA合成能力明显受到抑制，细胞凋亡明显增加，TGF-β1的表达亦明显受抑。与之相反，缺失p53基因的Hep3B需要同时共转染p53基因后，方出现抑制效应。结论：GADD45β基因能够有效抑制肝癌细胞的生长．其功能需要完整p53基因的辅助和(或)调控。GADD45表达和（或)功能异常，导致p53介导的DNA损伤修复途径异常或阻断，是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制。     

miRNA219-5P靶向调控Smad4表达影响TGF-β_1诱导肌腱成纤维细胞纤维化的研究

目的探讨mi RNA219-5P(mi R219-5P)调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts,TDFs)纤维化过程中的作用。方法取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs,取第3代细胞进行实验。化学合成mi R219-5P类似物(mimics)、阻遏物(inhibitor)及阴性对照序列,分别转染TDFs 48 h后,采用实时定量PCR及Western blot法分别检测mi R219-5P基因及Smad4蛋白表达情况;以正常细胞作为空白对照。信息学软件预测mi R219-5P与Smad4基因3’UTR区结合位点,构建Smad4预测基因3’UTR-PGL3重组质粒,构建野生型及突变型报告基因表达载体,并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证。取正常及转染后TDFs,采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化,于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化,72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标。结果 mi R219-5P mimics转染TDFs可明显上调mi R219-5P表达、下调Smad4蛋白表达,而mi R219-5P inhibitor抑制细胞内mi R219-5P表达、增加Smad4蛋白表达,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。荧光素酶实验显示,与p GL3-WT-Smad4转染组比较,p GL3-WT-Smad4+mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、p GL3-WT-Smad4+inhibitor转染组活性增强(P0.05);而p GL3-MT-Smad4+mimics转染组、p GL3-MT-Smad4+inhibitor转染组组间比较无明显变化(P0.05)。与空白对照组比较,TGF-β_(1)诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强(P0.01),同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达(P0.01);与直接诱导组比较,mi R219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制,而mi R219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强,差异有统计学意义(P0.01)。结论 mi R219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达,显著抑制TGF-β_(1)诱导TDFs纤维化。     

奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞中DNA损伤修复基因GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探索奥沙利铂对不同p53状态肝癌细胞的DNA损伤修复基因(GADD45β)诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53.体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618至-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53.以实时荧光定量PCR比较奥沙利铂对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 奥沙利铂对Hep3B中GADD45β诱导并不明显.转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对奥沙利铂的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示奥沙利铂作用Hep3B+p53后的启动子NF-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.5倍和0.8倍.奥沙利铂能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,100 μmol/L奥沙利铂作用后Hep3B+p53DNA合成率为30.41％,对细胞克隆形成能力的抑制率则达到75.60％,与Hep3B相比差异显著.奥沙利铂作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对铂类化疗药物对肝癌细胞的GADD45β诱导具有重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.     

Smad4 siRNA对乳腺癌细胞侵袭力和MMP-9表达的影响

目的:探讨Smad4特异性小分子干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭力及MMP-9表达的影响。方法:构建Smad4 siRNA,将细胞分为空白对照组,Smad4 siRNA转染组,TGF-β处理组,Smad4 siRNA转染+TGF-β处理组。首先用Western blot法检测转染Smad4 siRNA后细胞中Smad4蛋白的表达,以及用荧光素酶报告基因法检测TGF-β处理后细胞Smad结合元件(4xSBE)的活性;然后用Transwell小室模型和Western blot法检测各组细胞的黏附侵袭能力以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果:转染Smad4 siRNA后,乳腺癌细胞的Smad4蛋白表达及其TGF-β诱导的4xSBE活性增强均被明显抑制(均P<0.05);与对照组细胞比较,细胞经TGF-β刺激后的侵袭能力及MMP-9的表达量均明显增加(均P<0.05),但预先转染Smad4 siRNA的细胞的上述TGF-β刺激作用被明显抑制(均P<0.05),单纯Smad4 siRNA转染对细胞的侵袭能力及MMP-9的表达量无明显影响。结论:Smad4 siRNA能减弱TGF-β诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,该作用可能与其抑制MMP-9的表达有关。     

SUMO-1对p53基因诱导HepG2细胞凋亡的增强作用

目的研究小分子泛素样修饰体1(smallubiquitin likemodifier1,SUMO1)在野生型p53基因诱导HepG2细胞凋亡中的作用。方法用含人野生型p53基因质粒pcDNA3wtp53(pwtp53)、含人双微粒体基因2〔(humandoubleminutegene2(HDM2);鼠同源基因为MDM2〕质粒pCMV HDM1B(pMDM2)、含人SUMO1基因质粒pcDNA3His6SUMO1(pSUMO1)和空质粒pcDNA3分别或同时转染HepG2细胞,获得各转染细胞系,应用Westernblot检测转染后细胞中质粒蛋白的表达及流式细胞技术检测细胞凋亡比例。结果转染pwtp53和pMDM2质粒的HepG2细胞均可见p53及MDM2蛋白条带,同时转染pSUMO1质粒的细胞分别可见被SUMO1修饰的相对分子量较大的p53和MDM2蛋白条带,在未转染任何质粒、仅转染空质粒和pSUMO1质粒的细胞中只检测到少量p53蛋白表达。转染pwtp53及pwtp53+pSUMO1质粒的HepG2细胞凋亡比例分别为(16.79±1.62)%和(18.15±1.36)%,转染pwtp53+pMDM2+pSUMO1质粒的细胞凋亡比例为(14.06±1.84)%,转染pwtp53+pMDM2质粒的细胞凋亡比例则下降至(5.17±1.23)%,与前三者比较差异有显著性意义(P<0.01);其他转染系细胞中的细胞凋亡比例均≤2%,差异无显著性意义。结论SUMO1通过与p53蛋白的结合或翻译后修饰,抑制MDM2等癌基因蛋白对p53蛋白的降解,可增强p53抑癌基因诱导的细胞凋亡。     

3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲对不同p53状态肝癌细胞中生长抑制及DNA损伤诱导基因45β的诱导差异及其机制

目的 探讨3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine)对不同p53状态肝癌细胞的生长抑制及DNA损伤诱导基因45β(GADD45β)诱导差异及其调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53;体外合成GADD45β近端6个启动子序列群(-618 ～-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53;以实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)比较Triapine对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;进一步比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;并通过半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的表达变化测定细胞凋亡的发生和发展.结果 Triapine对Hep3B中GADD45诱导并不明显,Hep3B+p53对Triapine敏感性明显增加,2.5、5.0μmol/L剂量下GADD45/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)比值分别为0.0425和0.0704,并呈现出剂量-效应的正相关关系.荧光素分析提示Triapine作用Hep3B+p53后的启动子核因子(NF)-κB(-618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.3倍和0.7倍.Triapine能够更加明显地抑制Hep3B +p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,5μmol/L Triapine对Hep3B +p53DNA合成的抑制率为40.89％,对细胞克隆形成能力的抑制率达到68.16％,与Hep3B比较差异有统计学意义(P＜0.05).Triapine作用后Hep3B+p53的Caspase-3能迅速激活,活性高峰提前出现于6h.结论 p53在核糖核苷酸还原酶抑制剂化疗药物对肝癌细胞的GADD45诱导中具有重要作用,其作用机制可能是增强转录调节因子的表达水平.     

羟基脲对不同p53状态肝癌细胞中GADD45β的诱导差异及调控机制

目的 探讨羟基脲对不同p53状态肝癌细胞的GADD45β诱导差异及可能调控机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B+p53;体外合成GADD45β近端启动子序列群(-618～-314),构建荧光素表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和Hep3B+p53;以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)比较羟基脲对GADD45β表达诱导及其近端启动子活性影响差异;比较对DNA合成和细胞克隆形成能力抑制差异;通过Caspase-3的表达变化测定凋亡的发生和发展.结果 羟基脲对Hep3B中GADD45诱导并不明显,转染p53全基因序列后,Hep3B+p53对羟基脲的敏感性明显增加,并呈现出剂量-效应的正相关.荧光素分析提示羟基脲作用Hep3B+p53后的启动子核转录因子( NF)-κB( -618/+6)和E2F-1(-470/+6)活性较Hep3B明显增强约1.1倍和0.8倍.羟基脲能够更加明显地抑制Hep3B+p53的DNA合成能力和细胞克隆形成能力,10 mmol/L羟基脲对Hep3B+p53DNA合成抑制率达到37.15％,对细胞克隆形成能力的抑制率达85.29％,与Hep3B比较差异有统计学意义(P＜0.05).羟基脲作用后Hep3B+p53的Caspase-3能够迅速地启动凋亡的发生和发展.结论 p53对核糖核苷酸还原酶抑制性化疗药物对肝癌细胞的GADD45诱导起重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.     

前列消汤干预TGF-β1/Smad4、Smad 7信号通路调控实验性自身免疫性前列腺炎小鼠前列腺成纤维细胞增殖与凋亡的研究

目的:观察中药方前列消汤干预TGF-β1/Smad4、Smad 7信号转导通路对实验性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠前列腺成纤维细胞(PrF)增殖与凋亡的调控作用。方法:采用C57BL/6小鼠制备前列消汤含药血清,根据细胞毒性实验结果,以5%、10%、20%的含药血清分别作为低、中、高剂量组进行干预实验。采用"免疫诱导+中医病因造模法"建立湿热证EAP小鼠模型,无菌条件下取出前列腺组织,分离培养PrF,采用差速贴壁法纯化PrF,免疫荧光法检测PrF纯度,纯度达90%以上即以5 ng/ml TGF-β1浓度的培养液刺激进行建模。取建模后对数生长期的PrF随机分为空白组(无血清培养液),模型组,阳性对照组(含TGF-β1浓度5 ng/ml的培养液),前列消汤低、中、高剂量组,每组6个复孔;干预培养24 h后检测各组PrF增殖情况,采用Western印迹检测TGF-β1的表达水平和Smad4、Smad7、p-Smad4、p-Smad7的表达水平,qPCR检测TGF-β1、Smad4、Smad7 mRNA的表达,流式细胞术检测PrF细胞凋亡情况。结果:经TGF-β1诱导后,与模型组比较,阳性对照组PrF细胞增殖明显(P0.05),前列消汤低、中剂量组PrF细胞增殖受抑制(P0.05),前列消汤高剂量组PrF细胞增殖受明显抑制(P0.01);与阳性对照组比较,前列消汤各剂量组PrF细胞增殖明显受到抑制(P0.01),且呈明显的量效关系。与模型组比较,阳性对照组Smad4、p-Samd7和TGF-β1蛋白表达显著增加(P0.05);经前列消汤含药血清干预后,与阳性对照组比较,前列消汤含药血清能显著下调PrF细胞内p-Smad4,TGF-β1蛋白的表达(P0.01),而增加p-Samd7的表达水平(P0.01)。qPCR结果显示,与模型组相比,前列消汤高剂量组Smad4基因表达有显著差异(P0.05),前列消汤低、中、高剂量组Smad7基因表达有显著差异(P0.05);前列消汤低、中、高剂量组TGF-β1基因表达水平显著上调(P0.01);与阳性对照组相比,前列消汤高剂量组Smad4基因表达有显著差异(P0.05),模型组、前列消汤低、中、高剂量组Smad7基因表达有显著差异(P0.01),前列消汤低、中、高剂量组TGF-β1基因表达水平显著下降(P0.01)。与模型组比较,阳性对照组PrF细胞凋亡率无明显差异(P0.05),前列消汤各剂量组凋亡率均显著提高(P0.05),且呈明显的量效关系。结论:经TGF-β1诱导可刺激PrF细胞增殖,上调TGF-β1、p-Smad4的表达,下调p-Smad7的表达。前列消汤可以抑制PrF增殖,且呈明显的量效关系,其机制可能与其降低TGF-β1和p-Smad4的表达、提高p-Smad7的表达从而阻断TGF-β1通过Smad4途径诱导PrF细胞增殖相关。     

骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢性胰腺炎的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠慢性胰腺炎(CP)的治疗作用及其机制。方法将SD大鼠随机分为空白组(尾静脉注射无菌生理盐水),模型组(尾静脉注射二氯二丁基酯制作大鼠CP模型),治疗组(造模后尾静脉注射BMSCs),假治疗组(造模后尾静脉注射无菌生理盐水),每组10只。取大鼠胰腺组织进行病理学评分及纤维化程度评分,ELASA法检测胰腺组织中胰腺星状细胞(PSC)活化表达的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),I型胶原蛋白,瓜型胶原蛋白水平,白细胞介素10(IL-10)水平;qRT-PCR法检测胰腺组织中PSC凋亡基因BNIP3的表达,Western-blot法检测胰腺组织中TGF-β/Smad信号传导通路中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表达水平。将CP大鼠PSC培养体系分为对照组(单纯PSC培养组)和治疗组(PSC和BMSCs共培养组),每组5份标本,ELASA法检测α-SMA,I型胶原蛋白,Ⅲ型胶原蛋白,IL-10的表达水平;qRT-PCR法检测PSC凋亡基因BNIP3的表达,Western-blot法检测TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表达水平。结果(1)治疗组大鼠胰腺病理学评分及纤维化程度评分均低于模型组与假治疗组,且差别有统计学意义(P<0.05);治疗组α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白水平,TGF-βl、Smad2、Smad3、Smad4的表达水平均低于模型组与假治疗组,且差别有统计学意义(P<0.05),但PSC凋亡基因BNIP3以及IL-10的表达水平高于模型组与假治疗组,且差别有统计学意义(P<0.05);(2)治疗组α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅰ型胶原蛋白水平,TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表达水平均低于对照组,且差别有统计学意义(P<0.05),但PSC凋亡基因BNIP3以及IL-10的表达水平高于对照组,且差别有统计学意义(P<0.05)。结论BMSCs可通过TGF-β/Smad信号传导通路抑制PSC增殖活化,减少胰腺纤维化的形成,进而控制慢性胰腺炎。     

秋水仙碱通过阻滞TGF-β1/Smads通路抑制胰腺星状细胞生物学行为的研究

目的:观察秋水仙碱对TGF-β1诱导的胰腺星状细胞增殖、凋亡活性的影响,探讨秋水仙素对抗慢性胰腺炎纤维化的可能分子机制。方法:实验分对照组和实验组,对照组不加秋水仙碱,实验组根据情况加入秋水仙碱和/或TGF-β1。实验组利用秋水仙碱干预TGF-β1诱导胰腺星状细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测胰腺星状细胞活化状态,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡情况,RT-PCR和Westernblot检测Tβ1R、Smads表达变化。结果:与对照组相比,TGF-β1可诱导胰腺星状细胞增殖(P0.05),降低凋亡率(P0.05);而秋水仙碱作用24h后胰腺星状细增殖明显减低(P0.05),凋亡明显增加(P0.05);抑制细胞的增长呈剂量依赖性。RT-PCR和Western blot检测显示秋水仙碱成功阻断TGF-β1/Smads通路的活化。结论:秋水仙碱抑制TGF-β1诱导的胰腺星状细胞增殖,促使胰腺星状细胞凋亡,其机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路的活化有关。     

Smad4小分子干扰RNA对转化生长因子-β诱导的纤溶酶原激活物抑制剂-1表达的影响

目的 探讨Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子(TGF)-β诱导纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1的表达的影响及作用机制.方法 将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞24h后行TGF-β(1μg/L)刺激,24、48 h后收集细胞.利用萤光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子的活性;Northern印迹分析技术检测PAI-1 mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、PAI-1蛋白的变化.结果 Smad4 siRNA能抑制Smad4蛋白(3.0±0.1比16.0±0.5)表达;Smad4 siRNA抑制TGF-β1和ALK5激活的4×SBE荧光素酶报告基因活性;TGF-β时间依赖性促进PAI-1 mRNA表达,24 h达高峰;Smad4 siRNA从mRNA(1.3±0.1比6.5±0.2)和蛋白(1.50±0.15比5.52±0.36)水平抑制TGF-β激活的PAL-1的表达.结论 Smad4 siRNA能够有效地阻断TGF-β诱导的PAI-1表达.     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化中的作用

目的 探讨Smad4在TGF-β诱导人胆管癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用.方法 用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理RBE人胆管癌细胞系24h后,观察其形态变化,采用Western Blotting检测TGF-β1处理0h、12h、24h、48h后RBE细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达.通过RNA干扰技术建立稳定干扰Smad4表达的细胞系,在无TGF-β1处理或TGF-β1处理24h后,观察Smad4干扰组与野生型组和空载体组细胞的形态差异,Western Blotting检测各组N-cadherin和E-cadherin的表达水平.结果 TGF-β1诱导RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变,促进 N-cadherin表达增加和E-cadherin表达降低.在无TGF-β1处理时,Smad4干扰组细胞比野生型组和空载体组细胞的形态更趋于上皮样,E-cadherin表达水平也显著高于野生型组和空载体组(P＜0.05).在TGF-β1处理24h后,Smad4干扰组细胞形态的间质样变化程度、N-cadherin表达量明显低于野生型组和空载体组(P＜0.05);野生型组和空载体组细胞E-cadherin的表达缺失,而Smad4干扰组细胞仍表达较高水平的E-cadherin,两者间差异显著(P＜0.05).结论 TGF-β依赖Smad4介导人胆管癌细胞发生上皮-间质转化.     

前列腺癌PC-3细胞中Wnt信号通路与TGF-β信号通路相互调节

目的研究前列腺癌PC-3细胞中Wnt与TGF-β信号通路之间的交互作用。方法应用荧光素酶报告基因系统研究2个信号通路的信号分子对另一信号通路是否具有激活或抑制作用,RT-PCR检测VEGF的表达。结果Wnt信号通路可以诱发TGF-β信号通路报告基因CAGA-luciferase的活性,β-catenin(WT),TCF4(WT),GSK3β(KM)可以激活CAGA,TCF4(DN)可以抑制CAGA;β-catenin(WT)与TCF-4(WT)、GSK3β(KM)与TCF-4(WT)可以协同激活CAGA。TGF-β信号通路也可以激活Wnt信号通路LEF-1荧光素酶活性。Smad7可以单独激活LEF-1荧光素酶活性,Smad3与Smad4可以协同激活LEF-1荧光素酶活性。β-catenin(WT)与TCF-4(WT)可以协同激活cy-clinD1启动子活性,Smad3抑制cyclinD1启动子活性。TGF-β可以上调PC-3细胞VEGF的表达,氯化锂可以增强TGF-β上调VEGF表达的作用。结论前列腺癌PC-3细胞中Wnt信号通路与TGF-β信号相互激活,对前列腺癌的发生发展有一定意义。     

p53对肝癌细胞中GADD45β表达诱导的影响及其调控机制

目的 观察p53对肝癌细胞GADD45β诱导的影响并探讨其机制.方法 转染p53全序列建立Hep3B~(+p53);比较S腺苷蛋氨酸对Hep3B~(+p53)的GADD45β表达诱导及其对近端启动子活性影响;比较DNA合成能力和细胞克隆形成能力及其对Caspase基因的影响.结果 Hep3B~(+p53)可以稳定表达p53蛋白;p53转染能使S腺苷蛋氨酸对Hep3B~(+p53)中GADD45β的表达诱导由0.0089增加至0.0192和0.0371,同时使启动子中3个核因子(NF)-κB活性分别增强1倍、50%和25%,Hep3B~(+p53)的DNA合成能力降至80.99%和42.53%,细胞克隆形成能力的抑制率为15.04%和90.42%;Hep3B~(+p53)的Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活性无明显变化.结论 p53在肝癌细胞的GADD45β表达诱导中有重要作用,增强转录调节因子的表达水平是其可能的作用机制.     

热疗诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及机制的研究

目的探讨不同温度热疗对人肝癌细胞Hep G2的凋亡作用。方法人肝癌Hep G2细胞常规方法培养,采用水浴加热法对实验组(41℃,42℃,43℃)和对照组(37℃)细胞进行加温(0.5 h)处理,处理后继续培养24 h。采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,免疫组织化学技术检测细胞凋亡相关蛋白P53的水平,实时荧光定量PCR法检测热疗作用后生存素(Survivin),caspase-9基因mRNA的表达变化。应用SPSS16.0软件进行统计学分析。凋亡率、P53蛋白值、caspase-9 mRNA表达水平等计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验或方差分析。P0.05差异有统计学意义。结果在37℃,41℃,42℃,43℃,细胞凋亡率分别为(9.58±1.22)%、(16.47±3.41)%、(20.07±1.85)%和(23.42±1.93)%;P53蛋白表达OD值分别为(0.083±0.015)、(0.145±0.024)、(0.267±0.031)、(0.389±0.019)。与对照组比较,survivin基因mRNA的表达量下降(P0.05),caspase-9基因mRNA的表达显著增加(P0.05)。不同温度热疗后,随着加热温度的增高,细胞凋亡率增加,促进了基因p53及caspase-9的表达,凋亡抑制基因survivin的表达量下降。结论通过热疗可以增加p53及caspase-9基因的表达,抑制survivin基因的表达,从而诱导肝癌Hep G2细胞凋亡。     

转化生长因子-β1基因修饰未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

目的 观察转化生长因子-β1 (TGF-β1)基因转染未成熟树突状细胞(imDC)对大鼠肝移植免疫耐受的诱导作用.方法 利用大鼠骨髓细胞诱导培养imDC,以脂质体介导的pIRES2-EGFP-hTGF-β1转染imDC,于移植前5d输注受体Lewis大鼠体内,移植后分别于3、7、10d抽血检测肝功能[总胆红素( TBIL)和谷丙转氨酶(ALT)]、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测白细胞介素-12(IL-12)水平、肝组织苏木素-伊红(HE)染色急性排斥反应病理评分、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测肝脏淋巴细胞的凋亡及观察各组大鼠肝移植后的生存时间.结果 TGF-β1组移植后肝功能(TBIL和ALT)优于各对照组(P＜0.05);TGF-β1组移植后3、7d血清IL-12浓度分别为71.03±10.70、80.88±14.23均低于各对照组(P＜0.05);TGF-β1组移植后7d出现交界性排斥反应,移植10 d后出现轻度排斥反应(P＜0.05);TGF-β1基因转染组移植后3、7、10d汇管区淋巴细胞凋亡指数分别为6.75±1.93、14.00±2.19、18.25±1.38,较各对照组均明显增高(P＜0.05);TGF-β1组大鼠移植后中位生存期为58 d,明显长于各对照组.结论 TGF-β1基因改造的imDC能诱导大鼠移植免疫耐受,在诱导器官移植耐受中有良好的应用前景.