低频脉冲磁场对大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖和体外血管化的影响

目的观察不同强度低频脉冲磁场对体外培养大鼠骨髓源肉皮祖细胞增殖、细胞周期、迁移和成血管能力的影响方法密度梯度离心法获得大鼠骨髓源内皮祖细胞,随机分为4组：对照组,1．0mT组,1．4mT组和1．8mT组除对照组外．其余各组用顿率为15Hz不同强度的厅波脉冲磁场刺激大鼠骨髓源内皮租细胞,2h／d,持续刺激5d,曝磁5d后,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法俭测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,划痕试验检测细胞迁移能力,管状结构形成试验和3维培养检测细胞成血管能力。结果1．0mT组和1．4mT组磁场促进内皮祖细胞增殖,使其细胞周期分布发牛改变,DNA合成期（S期）和合成后期（G2期）细胞比例增加,1．8mT组磁场也能促进内皮祖细胞增殖．但对细胞周期分布影响不明显。体外培养内皮租细胞迁移能力差,各强度磁场对其迁移能力也无明显影响。不同强度磁场均能够提高内皮祖细胞成血管能力,与对照组相比差异均有统计学意义[（14．0±1．6）比（11．0±1．6）;（19．2±1．9）比（11．0±1．6）：（15．4±1．1）比（11．0±1．6）,P均〈0．05]1．0mT和1．4mT磁场作用强于1．8mT磁场：结论磁场的生物学作用和磁场强度相关,1．0mT和1．4mT低频脉冲磁场促进大鼠骨髓源内皮祖细胞增殖和DNA合成并提高其成血管能力。     

雷帕霉素对大鼠骨髓源平滑肌祖细胞增殖及分化的影响

目的观察雷帕霉素对骨髓源性平滑肌祖细胞增殖及分化的影响,探讨影响动脉粥样硬化的骨髓源性平滑肌祖细胞与雷帕霉素洗脱支架抑制新内膜增生的关系。方法采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,接种于纤维连接素包被的培养板,加入不同浓度雷帕霉素(0.01~100μg/L),培养12天后,-αSMA免疫荧光染色鉴定骨髓源性平滑肌祖细胞,并在倒置荧光显微镜下计数。收集培养8天贴壁细胞,分别加入不同浓度雷帕霉素(0.1~200μg/L)培养24 h。分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室和粘附能力测定实验观察平滑肌祖细胞的增殖、迁移和粘附能力。结果雷帕霉素显著抑制骨髓单个核细胞分化为平滑肌祖细胞,0.1μg/L雷帕霉素作用12天,平滑肌祖细胞减少了70.9%±4.5%(P<0.01)。雷帕霉素也显著抑制平滑肌祖细胞增殖,其抑制作用随雷帕霉素浓度增加而增加,1μg/L雷帕霉素作用24 h使平滑肌祖细胞数量减少27.1%±4.5%(P<0.01)。0.1~200μg/L雷帕霉素显著抑制平滑肌祖细胞的粘附和迁移能力。结论雷帕霉素可抑制平滑肌祖细胞分化,并抑制平滑肌祖细胞增殖及迁移能力。     

三角波形低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 研究在固定时间和频率下,三角波形的低频脉冲磁场(LF-PMF)对大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）增殖、迁移以及细胞周期的影响。方法: 实验分为4组（对照组,1.0mT组,1.4mT组,1.8mT组）。对照组不加磁场干预;其余各组分别在频率为15 Hz,磁场强度分别为1.0mT、1.4mT和1.8mT,时间为4 h/d,连续照射3 d的条件下,用三角波形作用离体培养的大鼠CMECs。利用MTT法检测细胞增殖情况,transwell法观察细胞迁移状况,流式细胞仪技术检测细胞周期变化。结果: 1.4mT和1.8mT组磁场促进CMECs增殖的作用差异显著［(0.200±0.043)A值, vs.(0.159±0.037)A值,(0.225±0.042)A值,vs.(0.159±0.037)A值,P<0.05］。迁移能力与对照组相比也有显著提高［(27.20±4.76)个/视野 vs.(22.60±4.77)个/视野,(33.80±3.19)个/视野 vs.(22.60±4.77)个/视野,P<0.05］。CMECs在细胞周期中的分布发生改变,DNA合成期(S期)和合成后期(G2期)细胞的比例增加。1.0mT组LF-PMF胞对细胞增殖、迁移以及细胞周期的影响均不明显。结论: 低频脉冲磁场磁场对CMECs的生物学作用与磁场的强度相关,1.4mT和1.8mT组LF-PMF促进细胞增殖、迁移及使其DNA合成的能力提高。     

过表达Jagged1促老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移

目的 探讨过表达Jagged1对老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力的影响.方法 PBS冲洗1～2月龄和19～ 26月龄SD大鼠股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用含10％ FBS的DMEM/F12培养基差速贴壁法进行体外培养,以Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染和vWF免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为四组:对照组(未进行基因转染的老龄大鼠内皮祖细胞组)、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源内皮祖细胞组.荧光显微镜下计数GFP表达细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测Jagged1 mRNA和蛋白表达;Transwell培养和MTT法分别检测细胞迁移和增殖能力.结果 免疫组织化学、RT-PCR和Western blot检测均显示转染后Jagged1显著增高,PIRES2-EGFP-Jagged1转染组mRNA和蛋白表达均较对照组显著增强(P＜0.01);与对照组相比,过表达Jagged1显著增强老龄大鼠来源内皮祖细胞迁移和增殖能力(P ＜0.05或P＜0.01).结论 过表达Jagged1增强老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力.     

低频脉冲电磁场对CRP作用下大鼠EPC增殖、凋亡及NO分泌的影响

目的观察不同强度、不同作用时间的低频脉冲电磁场对C反应蛋白（CRP）作用下大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPC）增殖、凋亡及NO分泌能力的影响。方法密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPC,实验分为10组,即空白对照组、12mg/LCRP组以及CRP+不同强度、不同作用时间（0.2mT2h、4h;0.6mT2h、4h;1.0mT2h、4h;1.4mT2h、4h）低频脉冲电磁场组。MTT法检测CPR对EPC增殖能力的影响,流式细胞仪检测CRP对EPC凋亡率的影响,硝酸还原酶法检测EPC培养液中NO含量的变化。结果与空白对照组相比,12mg/LCRP可明显抑制EPC增殖及NO分泌能力,促进EPC凋亡（P<0.05）,0.6mT4h;1.0mT2h两组EPC增殖、NO分泌能力显著高于CRP组,EPC凋亡显著低于CRP组（P<0.05）。其余各组与CRP组相比无明显差异。结论12mg/LCRP可抑制EPC的增殖及NO分泌,促进其凋亡;0.6mT4h和1.0mT2h电磁场可拮抗CRP对EPC的作用,磁场对CRP环境下EPC的作用无强度及时间依赖性。     

成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨成人骨髓源内皮祖细胞（EPCs）体外分离培养的可行性。方法抽取成年男性骨髓,体外全骨髓培养,传代后采用免疫微珠分选方法收集CD南细胞,EGM—MV2条件培养基诱导培养EPCs,观察细胞形态、生长情况;采用流式细胞技术检测分选细胞纯度,免疫荧光法检测EPCs特殊分子标志物CD34,CD133和VE-cadherin表达,透射电子显微镜观察分选细胞超微结构,UEA-1和Dil-ac-LDL双染色法检测分选细胞的吞噬功能。结果分选后细胞培养第3天出现集落样生长,集落边缘细胞形态伸展呈梭形或多边形,传代后呈现串珠样排列;培养至5～6d,细胞连接成大片条索状结构;CD34^＋、CD133^＋细胞百分率分别为24．13％、93．29％,其表面特异性表达CD133、CD34、VE-cadherin,具有EPCs形态特征,能吞噬Dil-ac-LDL并结合UEA-1。结论成人骨髓来源的EPCs经体外培养后形态、增殖率、生存能力、表面标志表达、功能等均较为稳定,可作为心血管组织工程种子细胞或用于干细胞治疗。     

bFGF和PDGF-BB对内皮祖细胞分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞增殖和迁移的影响

目的探讨内皮祖细胞分化的内皮样和平滑肌样细胞在碱性成纤维生长因子和血小板源生长因子BB作用下的增殖和迁移能力。方法将分离、培养及纯化的内皮祖细胞培养5天后进行分组:对照组、碱性成纤维生长因子组和血小板源长因子BB组。对照组使用20%胎牛血清的DMEM培养基;碱性成纤维生长因子组和血小板源生因子BB组在20%胎牛血清的DMEM培养基中分别添加碱性成纤维生长因子(30μg/L)和血小板源生长因子BB(40μg/L)。免疫荧光染色鉴定内皮祖细胞以及检测内皮祖细胞内皮方向分化标记物CD31和vWF,及平滑肌方向分化标记物α-SMA和Calponin。将分化的内皮样细胞和平滑肌样细胞用MTT法和Transwell小室分别检测其增殖活性和迁移能力。结果与对照组比较,内皮祖细胞经碱性成纤维生长因子或血小板源生长因子BB诱导后呈现较强的内皮细胞(CD31,vWF)或平滑肌细胞(α-SMA,Calponin)的荧光染色,被诱导细胞分别称为内皮样细胞和平滑肌样细胞;碱性成纤维生长因子促进内皮样细胞和血小板源生长因子BB促进平滑肌样细胞增殖的作用在一定范围内具有时间(0～48 h)和浓度(碱性成纤维生长因子:0～16μg/L;血小...     

C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响

目的研究C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成及其功能活性的影响,探讨C反应蛋白在动脉粥样硬化病变发展中的可能作用机制。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓内皮祖细胞,并用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的植物凝集素双染,在共聚焦显微镜下观察。将细胞与不同浓度C反应蛋白(0、1、5及10 mg/L)共同培养,建立内皮祖细胞与大鼠心脏微血管内皮细胞共同培养的体外血管形成模型。分别用MTT比色法、Transwell小室、Matrigel检测C反应蛋白对内皮祖细胞增殖活性、迁移及管腔形成能力的影响。用Western blotting分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax、整合素β2和内源性血管内皮生长因子的表达。结果随着浓度的增加,C反应蛋白明显减少内皮祖细胞掺入模型中心脏微血管内皮细胞管腔结构的数量,减弱内皮祖细胞的增殖活性,减少迁移的细胞数及形成的管腔数,上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白、整合素β2、内源性血管内皮生长因子的表达。结论 C反应蛋白减弱了内皮祖细胞参与血管形成的能力,这与其抑制内皮祖细胞的功能活性有关,从而可能促进了动脉粥样硬化等缺血性疾病的发展。     

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞分化的不同影响

目的：观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞（SPC）和内皮祖细胞（EPC）分化的影响。方法：采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀（0．01～10μmol／L）培养8d。采用平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定FITC—UEA—I和Di I-acLDL双染阳性细胞为正在分化的EPC,并在倒置荧光显微镜下计数。结果：辛伐他汀显著抑制骨髓单个核细胞分化为SPC。0．01μmol／L辛伐他汀组与对照组SPC数量分别为79±5对85±4（P〈0．05）。辛伐他汀显著促进骨髓单个核细胞向EPC分化,其促进作用随辛伐他汀浓度升高而增加,在1．0μmol／L达最大效应。1μmol／L辛伐他汀组与对照组EPC数量分别为87±5对39±4（P〈0．01）。结论：辛伐他汀选择性抑制骨髓单个核细胞向SPC分化,促进其向EPC分化,局部应用有促进损伤血管再内皮化和抑制新生内膜过度增生的可能。     

血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究

目的观察血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞迁移,参与血管新生的作用。方法SD大鼠随机分为生理盐水组（对照组）及血府逐瘀汤高、中、低剂量组,灌胃给药8d后,腹主动脉采血,分离含内皮祖细胞的单核细胞,进行细胞计数;血清中一氧化氮（NO）和血管内皮生长因子（VEGF）含量检测以及流式细胞仪分析细胞表型和细胞周期。结果虽然各组大鼠骨髓单核细胞数量、增殖能力以及VEGF受体（VEGFR）的表达无统计学意义（P〉0.05）;但药物促进NO的合成和分泌,对VEGF的影响作用正好相反,尤其中、高剂量组影响显著（P〈0.05）;且中剂量组能明显增加CD31的表达为25.20%±0.94%（P〈0.05）。结论血府逐瘀汤通过NO途径动员骨髓中内皮祖细胞释放,参与血管新生,说明药物能动员骨髓中内皮祖细胞迁移至外周血中,提高循环血中内皮祖细胞的数量。     

雌二醇对骨髓内皮祖细胞部分生物学功能的影响

目的观察雌二醇对体外培养骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量及增殖、迁移、黏附功能的影响。方法密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,FITC-荆豆凝集素I、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定。单个核细胞培养4天后进行实验分组,分为对照组和雌二醇治疗组。雌二醇治疗组加入不同浓度雌二醇(分别为0.001、0.01、0.1μmol/L)培养48 h,然后分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定来观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果雌二醇剂量依赖性增加EPCs数量并显著改善了EPCs的黏附、迁移和增殖能力,与对照组比较差异显著。结论雌二醇可增加培养EPCs的数量并改善EPCs部分生物学功能。     

血管内皮生长因子调节内皮祖细胞生物学功能

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）对体外培养骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）数量及增殖、迁移、黏附功能的影响及机制初探。方法密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,FITC-荆豆凝集素I、DiI-乙酰化低密度脂蛋白荧光双染鉴定。单个核细胞培养7d后分为对照组和VEGF干预组。VEGF干预组加入不同浓度VEGF（25,50,75,100μg／L）培养48h,分别采用四氮唑溴盐比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的增殖、迁移和黏附能力。RT—PCR法半定量检测VEGF对EPCs内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响。硝酸还原酶法比色测定VEGF对EPCs分泌一氧化氮的影响。结果VEGF可浓度依赖性地增加EPCs数量并明显促进EPCs的黏附、迁移和增殖能力,与对照组比较差异显著。VEGF可上调EPCseNOSmRNA的表达,促进EPCs分泌一氧化氮。结论VEGF可能通过上调EPCseNOSmRNA的表达影响EPCs部分生物学功能。     

辛伐他汀对大鼠平滑肌祖细胞和内皮祖细胞迁移的影响

目的观察辛伐他汀对平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cell,SPC)和内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell,EPC)迁移的影响,筛选新一代包被洗脱支架药物。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,重悬于SPC培养基或EPC培养基,接种在纤维连接素包被培养板,平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色鉴定骨髓源性SPC,激光共聚焦显微镜鉴定Dil标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)双染阳性细胞为正在分化的EPC。分别收集培养8 d的SPC和EPC,加入不同浓度辛伐他汀(0,0.01,0.1,1,10μmol/L)培养24 h。采用改良Boyden小室检测SPC和EPC迁移能力。结果辛伐他汀显著抑制SPC迁移,0.01μmol/L辛伐他汀作用24 h,迁移SPC数量减少,0.01μmol/L辛伐他汀组与对照组SPC迁移比较,差异有统计学意义(39±3 vs.44±3,n=5,P0.05)。与SPC相反,辛伐他汀显著促进EPC迁移,其促进作用随辛伐他汀浓度升高而增加,1.0μmol/L时达最大效应,1.0μmol/L辛伐他汀组与对照组EPC计数比较,差异有统计学意义(37±5 vs.6±3,n=5,P0.01)。结论辛伐他汀选择性抑制SPC迁移,促进EPC迁移,其双向调节作用呈浓度依赖性,局部应用有促进损伤血管再内皮化和抑制新内膜过度增生的可能。     

血管紧张素Ⅱ对骨髓源内皮祖细胞增殖能力的影响及机制的探讨

目的研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨髓源内皮祖细胞(EPCs)增殖能力的影响,并探讨其可能机制。方法通过密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,进行诱导分化,培养7天获得EPCs。抗AC133与抗血管内皮生长因子受体对EPCs双标后进行激光共聚焦鉴定。收集贴壁细胞加入不同浓度AngⅡ(10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)进行干预,MTT法观察EPCs增殖能力的变化,并利用RT-PCR法观察不同浓度AngⅡ干预及缬沙坦、蛋白激酶C(PKC)抑制剂预处理后EPCs的Flk-1 mRNA表达量的变化。结果在血管内皮生长因子(VEGF)存在的前提下,AngⅡ可以增强EPCs的增殖能力,并可以上调Flk-1 mRNA的表达。缬沙坦、抑制剂可以显著抑制AngⅡ的这种作用。结论AngⅡ可以通过1型受体、PKC通路上调EPCs的Flk-1,在VEGF的作用下促进其增殖,从而有助于血管新生。     

犬骨髓成年多能祖细胞诱导分化血管内皮细胞的实验研究

目的内皮细胞移植对损伤组织的修复治疗至关重要,本研究旨在探讨骨髓成年多能干细胞(MAPCs)体内外诱导分化血管内皮细胞的可行性.方法采用Percoll密度梯度法分离培养MAPCs.应用10 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)对骨髓MAPCs进行体外诱导分化2～3周,使其定向分化成为血管内皮细胞.采用细胞形态学、细胞免疫组化以确定诱导分化的效果.将标记BrdU的MAPCs自体移植于犬心肌内,观察局部微环境对于骨髓MAPCs的分化能力.结果应用10 ng/ml VEGF孵育骨髓MAPCs 2～3周,可见MAPCs分化为血管内皮细胞:细胞形态呈鹅卵石样;形成血管样结构;细胞vWF免疫染色阳性.移植于心肌内的MAPCs在体内形成新生血管,血管内皮BrdU染色与vWF染色均阳性.结论骨髓MAPCs可在体外VEGF诱导下或在体内微环境作用下分化为成熟血管内皮细胞.骨髓MAPCs可为损伤组织的移植修复治疗提供内皮细胞资源.     

Effects of benazepril on functional activity of endothelial progenitor cells from hypertension patients

The effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors on hypertension patients regarding endothelial progenitor cell (EPC) functions is poorly understood. The aim of this study was to investigate the effects of benazepril on the proliferation, adhesion and migration capacity of EPCs and its possible mechanism. The functions of EPCs from hypertension patients were obviously reduced compared with control group, and this could be improved by benazepril in a dose-dependent manner, whereas this improvement were obviously blocked when AMD3100 were used together. Therefore, benazepril could obviously improve functions of EPCs from hypertension patients, and the potential mechanism may be related to SDF-1/CXCR4 axis.     

吡格列酮和胰岛素对内皮祖细胞增殖和凋亡及分泌一氧化氮的影响

目的观察吡格列酮和胰岛素对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)的增殖能力、凋亡及分泌NO能力的影响,并探讨其机制。方法取正常SD大鼠32只,随机分为吡格列酮组和非吡格列酮组,各16只,分别给予吡格列酮和生理盐水灌胃预处理。喂养10天后,断颈处死,密度梯度离心法取骨髓单个核细胞,在M199培养液中培养扩增EPCs并进行鉴定。贴壁细胞培养4天后,将吡格列酮组EPCs消化后进一步分为两组,分别给予胰岛素(1nmol/L)或空白干预,非吡格列酮组EPCs处理同吡格列酮组EPCs。24h后检测NO水平,3天后检测凋亡情况,7天后检测细胞增殖能力。结果吡格列酮预处理能提高EPCs数量(P<0.01),吡格列酮预处理和(或)体外给予胰岛素干预组EPCs与未处理组细胞相比EPCs增殖能力提高(P<0.01),凋亡程度降低(P<0.05),培养上清中NO浓度增加(P<0.05)。结论体内吡格列酮预处理与体外胰岛素干预均能促进EPCs增殖,抑制EPCs凋亡,并促进EPCs分泌NO,且两种药物联合应用具有协同作用。