小鼠SRS白血病病毒前病毒DNA片段的分子克隆

从重组质粒pSF_(11)中提取SRS白血病病毒(SRSV)5kb DNA片段,用双脱氧法对其两末端进行测序,每端测得约150bp,从中筛选出PCR引物。SRSV新鲜感染NIH/3T3细胞,从感染细胞的胞质内提取前病毒DNA。用PCR法对SRSV前病毒DNA中的约3.4kb片段进行扩增,扩增产物用BamHⅠ酶切后与碱性磷酸单酯酶处理的pUC_(19)载体连接,并转化大肠杆菌JM_(103),得到含约3.4kb前病毒DNA片段插入子的重组质粒,并经Southern Blot证实,定名为pSF_(12),该克隆的SRSV DNA片段含有部分的env和pol基因。pSF_(12)和pSF_(11)构成SRSV的完整基因克隆。     

HMGB1对人肝癌细胞株HepG2体外增殖的影响

目的：观察HMGB1对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响并初步探讨其可能机制。方法：采用不同剂量(0,10,50,100 ng/mL)重组HMGB1(rHMGB1)刺激HepG2细胞24 h,用MTT法检测HepG2细胞增殖,Western印迹和RT PCR法检测cyclin D1,PCNA的表达。结果：不同剂量(10,50,100 ng/mL)rHMGB1组HepG2细胞增殖能力均明显高于对照组（P＜0.05）。HMGB1抗体（20 μg/mL）能中和HMGB1(10ng/mL)对HepG2细胞的促增殖作用（P＜0.05）。Western印迹和RT PCR显示,与对照组比较,HMGB1能明显促进HepG2细胞PCNA,cyclin Dl蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,HMGB1抗体能明显抑制HMGB1上调PCNA,cyclin Dl蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）。结论：HMGB1可能通过上调cyclin Dl和PCNA表达,促进HepG2细胞增殖。HMGB1抗体对肝细胞癌可能有治疗作用。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5Nl血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性.方法 PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达.采用细胞免疫荧光、Western blotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析.结果 在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64 000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Western blotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合.结论 经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础.     

用脱脂奶粉代替小牛胸腺DNA进行核酸分子杂交

本文应用脱脂奶粉代替小牛胸腺DNA等大分子物质配制预杂交液和杂交液进行核酸分子杂交,同时用经典的含小牛胸腺DNA等大分子物质的预杂交液和杂交液作为对照。结果表明,用脱脂奶粉可以代替小牛胸腺DNA等大分子物质进行核酸分子杂交,此法经济,配制简便,实际可用。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。     

STUDY ON GMA-DNA ADDUCTS

Objective. DNA modification fixed as mutations in the cells may be an essential factor in the initiation step of chemical ca~inogenesis. In order to explore the mechanism of gene mutation and cell transformation induced by glyaldyl methacrylate (GMA), the current test studied the characteristics of GMA-DNA adducts formation in vitro. Methods. in vitro test, dAMP, dCMP, dGMP, dTMP and calf thymus DNA were allowed to react with GMA (Glycldyl Methacrylate). After the reaction, the mixtures were detected by UV and subjected to reversed-phase HPLC on ultrasphere ODS reversed-phase column, the reaction products were eluted with a 1inear gradients of methanol (solvent A) and 10mmol/L ammonium formate, pH5.0 (solvent B).The synthesized adducts were then characterized by UV spectroscopy in acid (pH1. 0), neutral (pH7.2),alkaline (pH11.0) and by mass speetroacopy. Results. The results showed that GMA could bind with dAMP, dCMP, dGMP and calf thynms DNA by covalent bond, and the binding sites were specific (N6 of adenine, Na of cytosine). Meanwhile, a main GMA-DNA adduct in the reaction of GMA with calf thymus DNA was confirmed as N3 methaerylate-2-hydroxypropyl-dCMP. Conclusions. GMA can react with DNA and /or deoxynucleotide monophosphate and generate some adducts such as N6-methaerylate-2-hydroxypropyl-dAMP and N3 methacrylate-2 hydroxypropyl-dCMP,ets. Formation of GMA-DNA adducts is an important molecular event in gene mutation and cell transformation induced by GMA.     

日本血吸虫p50亲免素基因的扩增及其免疫学特性

目的扩增日本血吸虫(Sj)p50亲免素(IP)基因全长cDNA和DNA序列,进行原核克隆和研究其免疫学特性。方法从Sj成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框,从Sj成虫基因组中扩增其DNA序列,对其cDNA序列和DNA序列进行比较分析,寻找内含子。将其cDNA序列克隆入pET30a( )体中,原核表达并纯化表达产物,Western-blot比较重组蛋白与Sj体内相应天然蛋白的免疫原性和免疫反应性,间接免疫荧光法对p50亲免素进行组织定位。结果Sjp50IP基因DNA序列与cDNA相比,有6个内含子;重组p50IP与Sj体内的天然蛋白具有相同的免疫学特性,该蛋白位于Sj成虫的被膜上。结论成功扩增得到了Sjp50IP基因的全长编码区的cDNA序列和DNA序列,其DNA序列中有6个内含子;重组Sjp50IP的免疫学特性支持将该基因作为疫苗进行进一步的研究。     

人IL-12在昆虫细胞中的表达及其体外生物活性的检测

目的：建立表达具有生物活性的人IL-12 的杆状病毒/昆虫细胞表达系统。方法：将p40和p35 cDNA一起构建入杆状病毒转移载体pAcUW42,然后与杆状病毒AcUW1.lacZ DNA共同转染昆虫细胞Sf9,使两者产生同源重组;随后利用病毒空斑实验筛选重组的杆状病毒,再由ELISA筛选及鉴定表达IL-12的重组病毒,并进行Western Blotting和体外生物活性的检测。结果：经病毒空斑试验、ELISA和Western Blotting逐步阳性选择的IL-12重组杆状病毒,其感染Sf9细胞的上清与IL-12标准品一样具备刺激正常人外周血T淋巴细胞增生的生物活性。结论：本研究建立了能表达具有体外生物活性的人重组IL-12的杆状病毒/昆虫表达系统。     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中的表达与纯化

目的利用毕赤酵母高效表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）。方法利用基因定点突变技术对人TFPIcDNA特定序列进行定点突变（同义突变）。将获得的突变体及野生型cDNA分别插入表达载体pPic9中,转化酵母宿主菌GS115和KM71,用0.5%的甲醇诱导重组蛋白表达。细胞培养上清经超滤浓缩后,依次用DEAE-sepharose Fast Flow、Heparin-sepharose CL6B及Sephadex G-75柱层析分离纯化得到重组蛋白,分别采用凝胶扫描成像定量分析和底物显色法测定重组蛋白的表达量和活性。结果凝胶扫描成像定量分析显示,同义突变体的表达量（1mg/L）显著高于天然型（0.1mg/L）。活性测定表明GS115重组菌在诱导表达12h后即可于培养上清中检测到TFPI活性,36h达峰值;而KM71重组菌诱导表达24h后才开始于培养上清中检测到TFPI活性,72h达峰值。两个菌株中突变体mTFPI-pPic9转化子的表达量均显著高于TFPI-pPic9转化子。重组蛋白相对分子质量约为42000。结论对TFPI-cDNA特定序列进行同义突变后能显著提高重组蛋白在毕赤酵母细胞中的表达,且显著高于在酿酒酵母和昆虫细胞的表达;重组蛋白具有良好的生物活性。因此,利用毕赤酵母表达TFPI是一种较好的选择。     

SLE患者血清中抗dsDNA抗体的纯化及特异性分析

目的 :研究SLE患者血清中抗dsDNA抗体的结合特异性。方法 :用小牛胸腺 (CT)DNA或大肠杆菌 (EC)DNA纤维素层析柱从SLE患者血清中提纯抗dsDNA抗体 ,并通过酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测其结合特异性。结果 :小牛胸腺DNA纤维素纯化的抗dsDNA抗体与大肠杆菌dsDNA的结合很弱 ;同样 ,大肠杆菌DNA纤维素柱纯化的抗dsDNA抗体与小牛胸腺dsDNA的结合也很弱。结论 :SLE患者血清中的抗dsDNA抗体与不同物种DNA有着不同的结合特异性 ,可将其划分为不同的组群     

推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

目的 检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力.方法 通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JMl109后,IPTG诱导表达目的 蛋白,超声裂菌后发现目的 蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白.利用PCR与酶切方法 获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3'端进行生物素标记.最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力.结果 成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中.经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合.结论 成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础.     

NK4蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化、复性及活性测定

目的 在大肠埃希菌(E. coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性.方法 采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E. coli BL21(DE3),温控诱导表达目的 蛋白NK4.蛋白鉴定采用SDS-PAG...     

重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达

目的：探讨重组截短型人角质细胞生长因子1（rhKGF1_d23）蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1_d23蛋白的生产提供新的途径。方法：PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1_d23亚克隆到pFastbac载体。在辅助质粒的作用下,pFastBac-kgf1_d23载体Tn7片段转座到Bacmid 中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1。继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性。结果：昆虫偏好密码子改造的kgf1_d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1_d23和穿梭载体Bacmid-kgf1_d23载体中。SDS-PAGE 结果表明,重组蛋白在60 h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96　h;利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90%以上的杂蛋白。纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3~25.0 μg•L^-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0 μg•L^-1时达到平台期。结论：重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1_d23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性。     

蝙蝠SARS样冠状病毒S蛋白受体结合域在昆虫细胞中的表达和纯化

目的：在昆虫细胞表达系统中表达蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域,并探讨其表达动力学和纯化条件。方法：以PCR扩增蝙蝠SARS样冠状病毒Spike基因的受体结合域片段,产物连接到pMD-T载体,再亚克隆至供体质粒pFAST—HTB,经序列测定确认基因正确克隆,进一步将其转座入Bacmid中,在昆虫细胞S西中进行表达,采用SDS—PAGE和Westernblotting对表达产物进行分析,并通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域片段,当感染复数（multiplicityofinfectiin,MOI）为2时,重组病毒感染细胞56h后,重组蛋白的表达量达到峰值。结论：蝙蝠SARS样冠状病毒Spike蛋白的受体结合域片段在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达,并可通过镍离子螯合树脂纯化重组蛋白。     

溴乙锭荧光法测定环境污染物的DNA交联作用

目的：评价溴乙锭荧光法检测食用油烟、香烟烟气、蚊香烟气颗粒提取物、氧化型染发剂、硝基苯类化合物的ＤＮＡ交联作用。方法：ＤＮＡ交联溴乙锭荧光分析法（ＥＦＡ）基于双链间交联所致的ＤＮＡ在变性条件下不解链，与溴乙锭结合可产生较强荧光，而正常ＤＮＡ变性后形成的单链ＤＮＡ无此现象的原理对ＤＮＡ交联进行测定。结果：食用油烟和香烟烟气颗粒提取物、氧化型染发剂具有致小牛胸腺ＤＮＡ交联形成的作用，具有遗传毒性的蚊香烟气颗粒提取物和２，４－二硝基甲苯和间二硝基苯等硝基苯化合物未观察到致ＤＮＡ交联作用。结论：ＤＮＡ交联溴乙锭荧光方法灵敏、快速、简便，适用于对环境污染物ＤＮＡ损伤机制的研究。     

The Effectof the Lyso PC-induced Endothelial Cell Conditioned Medi-um on Proliferating Cell Nuclear Antigen Expression of the Calf Tho-racic Aorta Smooth Muscle Cell

Proliferation of aorta smooth muscle cells(ASMCs) and move towards aortas intima layer isthe fundamental pathological change in atheroscle-rosis(AS) .Plasma low density lipoprotein(LDL)and especially the increased density of oxidized(Ox- LDL can speed up the formation of AS[1] . Inthe process of oxidation of LDL,phos-phatidylcholine (PC) is changed into Lysophos-phatidylcholine (Lyso PC) and constitutes the mainphosphatide ingredient of Ox- LDL[2 ] . Owing tothe real expression of a…     

2种制备Taq DNA聚合酶方法的比较

目的比较2种制备纯化Taq DNA聚合酶的方法,为PCR提供实验用酶。方法Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,IPTG诱导12 h后收集菌体,分别用硫酸铵沉淀法和冻融法进行纯化,SDS-PAGE电泳和PCR扩增分析比较其纯度和活性。结果硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶活性能可有效扩增DNA片段;冻融法制备的Taq DNA聚合酶活性较低。结论硫酸铵沉淀法制备的Taq DNA聚合酶优于冻融法,能够达到分子生物学实验中基因扩增的要求。     

人巨细胞病毒B基因抗原编码区表达产物的初步应用

目的 人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）５２kd糖蛋白重组表达质粒（pＨＣＭＶ５２）经诱导、 增殖、提取并纯化表达产物。方法 采用同位素法（＾１２５Ｉprotein Ａ）和非同位素 法（碱性磷酸酶标记抗人ＩgＧ）检测了已知ＥＬＥＳＡＨＣＭＶ－ＩgＭ阳性和阴性血清各７７例和４例。结果 同位素汪与ＥＬＩＳＡ一致,非同位素汪阳性例为７５/７７例。表 达产物免疫家兔制备的抗血清,用ＡＢＣ法检测肝组织中ＨＣＭＶ抗原,发现ＨＣＭＶ５２