A型H1N1流感病毒2009年血凝素蛋白变异分析

目的:通过分析血凝素蛋白的演变规律探讨A型H1N1流感病毒的进化来源及流行特点。方法:利用生物信息学方法,比较A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株和与其相关的22株流感病毒血凝素蛋白序列的进化关系,重点分析A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株相关氨基酸位点的变异情况。结果:A/Mexico/4108/2009(H1N1)血凝素蛋白的蛋白酶剪切位点、受体结合位点以及表面抗原位点都与1918年和1976年暴发的H1N1流感病毒类似,可能涉及H1N1流感病毒在不同宿主间的传播、重组。结论:A/Mexico/4108/2009(H1N1)毒株的病毒毒力、感染性以及免疫原性发生了一定的变异,并且可能在变异过程中发生了向1918年和1976年的H1N1流感病毒的回复突变。     

H1N1型流感病毒血凝素抑制肽的筛选研究

目的以流感病毒血凝素(HA)为作用靶点,筛选新型抗流感多肽药物。方法通过噬菌体展示技术,从随机十二肽库中筛选HA结合肽,并对筛选获得的多肽进行细胞及鸡胚水平的抗H1N1活性验证。结果筛选获得了9条HA结合肽,其中H6具有显著的抗病毒活性,其抑制A/FM1/1/47(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)两株流感病毒致细胞病变的IC50值分别为37.3和48.5μmol/L,抑制两株病毒在鸡胚内复制的IC50值分别为26.7和33.4μmol/L。结论 H6有显著的抗H1N1活性,具有开发成新型抗流感病毒药物的潜力。     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析

目的：获得血凝素基因（HA）基因，将其克隆到真核表达载体，为研究流感DNA疫苗奠定基础。方法：从当年流感病人体内分离病毒（A／Guangdong/448/2001)，鉴定型别（H3N2）后，提取RNA，用特异引物进行RT－PCR,扩增HA，并将其克隆到pMD18-T Vector，进行序列测定和分析；然后将HA基因亚克隆到真核表达载体（pCI-neo)，进行鉴定。结果：获得一个核苷酸长度为1698bp的基因，编码565个氨基酸；与A／Beijing/32/92(Genbank/NCBI:U26830)基因序列有98％同源，有15个碱基和／或10个氨基酸出现变异，且在212缺失一个氨基酸V；酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体（HA－pCIN)。结论：成功构建了HA基因真核表达载体，可以进一步研究其免疫功能。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

2004-2005年宁夏A(H1N1)亚型流感病毒基因特性研究

目的了解宁夏流行的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素基因变异情况。方法对分离的A(H1N1)亚型毒株随机选取5株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,宁夏2004年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,35 D>N、152 G>R、182 P>S、221 D>G,其中152、221位氨基酸位于抗原决定簇;2005年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,82 T>K、94 Y>H、119 K>N、145 R>K、165 V>A、208 R>K、251W>R、266 T>N,其中165位氨基酸位于抗原决定簇。结论宁夏2004-2005年分离的A(H lN1)亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异。     

流感病毒血凝素疫苗研究进展

流感病毒是引起急性呼吸道疾病的重要病原之一,常常与其他病原体混合感染造成更严重的损害。流感在世界各地都有发生,对人类的健康构成严重威胁。由于流感病毒容易变异,血清型别众多,给流感疫苗研究带来极大困难。流感病毒表面有血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）两种主要的膜蛋白,流感病毒的抗原性和致病性很大程度上取决于血凝素,所以HA基因是研究得最多的流感病毒基因。本文对HA疫苗的研究情况进行综述,为进一步研究和开发流感疫苗提供参考。     

甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酰酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酰酶基因的进化规律.方法:通过NCBI数据库下载最新收录的甲型H1N1流感病毒基因序列(中国的北京、四川、山东、福建、台湾,美国的纽约和得克萨斯州,俄罗斯),采用DNAstar软件排列和修剪病毒各段基因序列并构建进化树.结果:不同地区分离到的2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酰酶编码基因均具有高度同源性(99%~100%),同一国别的亲缘关系更近,不同国别的亲缘关系稍远,尤其是中国和俄罗斯的关系最远,相近月份亲缘关系近.结论:此次新型甲型H1N1流感病毒来自同一传染源,且病毒到目前没有发生变异.     

新型甲型H7N9流感病毒血凝素基因进化分析

目的探讨2013年4月流行的新型甲型H7N9禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)基因的进化,以及氨基酸的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)中下载H7N9流感病毒以及有代表性的H7N2、H7N3、H7N7亚型流感病毒的HA基因序列,运用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)version 5.05软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析HA蛋白受体结合位点、糖基化位点和裂解位点的变化。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒与2011年浙江禽类H7N3流感病毒株(JQ906573.1)的相似性达到95.3%～95.6%;受体结合位点氨基酸发生变异,为Q226L,5个糖基化位点高度保守;HA裂解位点位于aa339和aa340之间,仅有1个碱性氨基酸:R。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒HA基因是由中国禽类H7亚型进化而来,Q226L变异导致的受体结合位点的变化可能是新型流感病毒具有人感染性的原因。     

苏格兰报告甲型H1N1流感病毒血凝素突变株D222G

苏格兰的一个研究小组从苏格兰西部收集了58例甲型H1N1流行性感冒患者的资料,包括社区感染病例和重症病例,并将重症甲流病例分为死亡组和治疗后痊愈组。检测58例甲流患者样本中流行性感冒病毒血凝素基因（HA）的HA1亚基并测序,研究结果发现死亡病例（2／23,8．7％）D222G的发生率高于社区感染病例和治疗后痊愈病例（0／35,0％）;     

H5N1人禽流感病毒HA基因的克隆和表达

目的对人禽流感病毒A/China/GD01/06（H5N1）HA基因进行克隆和表达,为进一步研究GD01/06HA的致病与免疫机制提供有效制剂。方法将H5N1全长HA基因克隆入原核表达载体pET-32a（＋）,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并对表达的重组蛋白进行鉴定。结果经检验重组质粒p32-HA构建成功,表达蛋白分子量介于66.2~94.0kd。经鉴定所表达的特异性条带为HA蛋白片段。结论HA基因在大肠杆菌中表达并获得特异性重组蛋白,为其生物学、免疫学功能的研究提供了基础。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的：对HSN1亚型禽流感病毒株(A/Qa／ST/852/01)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法：用RT-PCR方法扩增A/Qa／ST／852／01的ns1基因。之后以扩增产物为模板，采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰，将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中，并将其克隆到真核表达载体，构建pcDNA3．1/ns1重组质粒。结果：RT-PCR产物测序显示，A/Qa／ST／852／01 ns1基因开放阅读框全长678bp，编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论：成功将缺失的15个核苷酸片段引入A/Qa／ST／852／01的ns1基因中，重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律｡【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析｡ 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异｡【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况｡     

广州市一起水禽H5N1疫情禽流感病毒血凝素基因分析

目的了解广州市一起水禽H5N1疫情中高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因的特点以及与其他毒株序列间的关系。方法自疫点采集97份咽拭子标本及84份环境拭子标本,实时荧光RT-PCR检测H5核酸,从阳性标本中扩增全长HA基因并作序列测定,同2006年广州市及国内其他地区报道的人禽流感病毒HA基因进行比较并作系统发生分析。结果从一份环境拭子中扩增获得一株H5N1禽流感病毒HA基因,系统发生树分析发现与广州市2006年人禽流感病毒HA序列一致性较高,且与国内其他地区报道的H5N1病毒HA基因属于同一组;从基因序列推导出HA的氨基酸序列,发现其受体特异性为禽源的,蛋白酶水解位点含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。结论引发此次禽间禽流感的为高致病性H5N1病毒,和广州市人禽流感的H5N1病毒在遗传上有紧密的亲缘关系。禽源性的H5N1病毒仍存在感染人类的可能性,禽类从业人员目前处于感染高致病性禽流感的高危状态,进一步加强对活禽市场和禽类从业人员的监测,对于预防禽流感的流行具有重要意义。     

甲型H1N1流感病毒的分子特征

当前新型甲型H1N1流感病毒的暴发,引起全球的关注。本文对甲型H1N1流感病毒的分类地位、结构特征、基因复制、蛋白功能进行介绍,说明新型甲型H1N1流感病毒是甲型流感病毒通过抗原漂移和抗原转换所产生的,对奥塞米韦(达菲)敏感,但对金刚烷胺有抗药性。     

A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响研究

目的研究A(H1N1)甲型流感病毒基因多态性对病毒复制及毒力的影响。方法选择A/Californ ia/04/2009,A/S ichuan/1/2009和A/Be ijing/3/2009 3株病毒,分别感染MDCK细胞,测定病毒RNA载量和病毒效价;同时滴鼻接种BALB/c小鼠,检测小鼠感染后的多项指标,观察期为14天。另一方面,对3株病毒的全基因组进行测序及序列比对,对其基因突变情况及多态性进行分析。结果 A/S ichuan/1/2009株相较而言具有较高的复制能力及毒力,序列分析结果显示全基因中有5个氨基酸发生了突变,其中PA蛋白中343位点的A突变为T,PB1蛋白中353位点的K突变为R,566位点的T突变为A,PB2蛋白中471位点的T突变为M,对病毒毒力的增强起重要作用。结论 A(H1N1)甲型流感病毒基因组多态性与其复制及毒力密切相关。     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。