AP-1和ETS-1位点缺失的DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建及其活性研究

目的 研究AP-1和ETS-1转录因子结合位点(TFBS)缺失对树突状细胞特异性胞间黏附分子-3结合非整合素(DC-SIGN)启动子活性的影响,探讨DC-SIGN表达的机制.方法 从人外周血中提取全基因组DNA,设计DC-SIGN启动子序列上下游引物、转录因子结合位点两侧的引物及其相应的连接引物,利用PCR方法,通过不同的引物组合扩增出转录因子结合位点两侧的片段,再用连接引物连接两片段,得到转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列,通过双酶切、连接的方法,将得到的DC-SIGN启动子序列定向克隆入荧光素酶报告质粒,将上述质粒通过脂质体转染Hacat和293细胞,48 h后检测荧光素酶的活性.结果 体外扩增得到的转录因子结合位点缺失的DC-SIGN启动子序列以及重组的荧光素酶报告质粒经双酶切、基因测序鉴定正确,荧光素酶活性检测结果显示AP-1位点缺失使DC-SIGN启动子活性下降20%(293细胞)和10%(Hacat细胞),带增强子的DC-SIGN启动子活性下降了40%～50%;ETS-1位点缺失的普通型和带增强子型DC-SIGN启动子的活性几乎消失.结论 ETS-1转录因子结合位点在DC-SIGN启动子活性表达中起重要作用,AP-1转录因子结合位点作用不大.     

真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的计算机预测

启动子是基因组序列中靠近基因转录起始位点的区域,是影响基因表达的重要功能单位之 一。除实验方法发现或验证序列的启动子外,现已经有多种启动子序列的计算机预测方法,如位点比重 阵列(PWM)、隐马尔柯夫模型(HMM)、神经网络、低聚复合物和CpG岛等。本文综述了现有真核生物基 因启动子序列的生物信息研究技术。     

神经组织特异性启动子的研究方法和进展

基因表达调控的机理是分子生物学研究的热点和前沿。而启动子的调控在转录环节中又占有十分重要的地位。因此,研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义。在基因工程和基因治疗技术蓬勃发展的今天,启动子对外源基因的表达水平影响很大,是基因工程和基因治疗表达载体的一个重要元件。要使克隆的基因能够在目的细胞中表达,启动子最好是超强的组织特异性启动子。将外源基因有效的导入神经细胞并使其靶向、高效和长期稳定的表达是目前基因治疗神经系统疾病的主要靶点。随着研究的深入,越来越多的组织特异性启动子已被用于调控目的基因在靶细胞或靶组织中的表达,成为基因治疗研究领域的热点之一。现综述目前常用的几种中枢神经系统组织特异性启动子在基因治疗中的应用及其研究进展。     

hTERT启动子的转录调控机制及其靶向性介导肿瘤治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,在绝大多数恶性肿瘤细胞中呈阳性表达,而在正常体细胞中则一般为阴性。端粒酶的活性表达主要是通过hTERT基因的转录机制严格调控的。端粒酶的活化与肿瘤的发生发展及细胞衰老和永生化关系密切。hTERT基因启动子为恶性肿瘤早期诊断、预后评估及基因治疗提供了新的思路。     

转录抑制因子ZHX2对AFP启动子的抑制作用

目的：探讨转录抑制因子ZHX2对人甲胎蛋白（AFP）启动子的抑制作用。方法PCR扩增人ZHX2基因，构建ZHX2与绿色荧光蛋白和HA-tag融合表达载体pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA，共转染后通过荧光显微镜及Western blot检测融合基因的表达。扩增人AFP核心启动子269bp插入pGl3-Basic，构建报告质粒phAF269。将pcDNA-ZHX2-HA和phAF269共转染HepG2细胞。48h后裂解细胞，双荧光检测分析ZHX2对AFP启动子的抑制作用。结果荧光显微镜及westem blot检测证实pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA可在体外有效表达ZHX2融合蛋白，双荧光实验表明报告质粒phAF269具有AFP启动子活性，且pcDNA-ZHX2-HA与phAF269共转染HepG2后可显著抑制AFP启动子的转录作用，此抑制作用具有剂量依赖性。结论：成功构建两种新型转录抑制因子ZHX2融合表达载体，并证实其对人AFP启动子的抑制作用，为进一步探讨肝癌发生中AFP表达调控机制及提高AFP介导的靶向肿瘤基因治疗提供基础资料。     

特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中启动效率研究

目的证明人端粒酶亚单位（hTERT）启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法先使用RT-PCR检测各细胞系中hTERT mRNA的表达,再使用PCR方法扩增hTERT启动子基因的不同长度片段,并构建重组质粒,使用BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒并测序。最后使用Dual-Glo Luciferase Assay System激发荧光检测各细胞系中重组质粒中hTERT启动子的启动效率。结果 pGL3-204、pGL3-378、pGL3-1375重组质粒中的hTERT启动子序列与预期一致,质粒构建成功。hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒在H460中启动效率最强可以达到SV40启动子的80%,而在FRO、U251中启动效率可以达到SV40启动子的30%左右。hTERT全长启动子序列的启动效率在ARO细胞系中比pGL3-204、pGL3-378中的启动子片段启动效率强,而在FRO、H460和U251细胞系中pGL3-204中的启动子片段启动效率最强。结论 hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒,可以实现只在肿瘤细胞系中表达,但在正常细胞中不表达的效果。     

电离辐射影响成纤维细胞基因调控网络的初步研究

目的探讨电离辐射影响人成纤维细胞基因表达的转录调控机制，并构建基因与相应转录因子的调控网络。方法先对前期研究已经获得的差异表达基因进行功能注释，选择结合功能类基因（数量最多）进入研究；再用MaxLAPS，TFME和SCOPE3种软件预测这些基因的转录因子和转录因子结合位点；利用Bibliosphere软件构建转录因子与基因的转录调控网络。结果获得25条Gene Symbols，基因本体功能注释集中于结合功能（共19条），2种程序预测得到14个相同的转录因子，得分最高的6个转录因子结合位点对应的转录因子与预测的基本一致。按照最高水平标准构建的转录调控网络，显示CASPASE-3位于网络的核心。结论电离辐射很可能经转录因子TP53介导CASPASE-3激活而致人成纤维细胞凋亡。     

ASPP2基因启动子区DNA甲基化及转录因子DNA结合位点的干湿研究

对p53凋亡刺激蛋白2 (ASPP2)基因启动子区进行了甲基化及转录因子结合位点(TFBS) 的生物信息学分析及实验研究.结果表明,在该基因近端启动子区存在一个长1391bp的CpG岛,且此区域中包含19个转录因子的37个结合位点,其中有13个转录因子的结合位点含有CpG;甲基化预测发现在含CpG的23个TFBS中有18个位点的CpG易发生甲基化.由此推断ASPP2是典型的多因子调控的CpG岛基因,CpG岛的异常甲基化将影响转录因子结合,导致ASPP2基因表达下调.通过对人肝癌细胞株HepG和人成纤维细胞HFL-1的ASPP2基因启动子CpG岛中含4个E2F结合位点区域的甲基化实验检测,证明这种推断是正确的.这一研究说明,对重要基因启动子区DNA甲基化及TFBS的生物信息学研究可为相关的实验研究提供指南,对促进基因表达的表观遗传调控研究具有重要意义.     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

Eukaryotic Promoter Recognition Using Back propagation Neural Network

A new system is developed to recognize promoter sequences from non-promoter sequences based on position weight matrix and backpropagation neural network in this paper. The system performs significantly better on the training set and the test set, the mean recognition rate is as high as 99% on the training set and 97% on the testing set. Experimental results demonstrate the effectiveness of the system to recognize the promoter sequences that have been trained and the promoter sequences that have not been seen previously.     

抗重组人肿瘤坏死因子-α(rHTNF-α)单克隆抗体特性及功能的研究

应用杂交瘤技木制备抗重组人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体对于r-HTNF-α的纯化和TNF-α分子的抗原性及功能的研究将是一种主要工具。本实验对一组抗rHTNF-α单克隆抗体的特性和功能进行了研究。Western blotting结果表明Z_4、Z_8、Z_(12)、Z_ (20)、Z_(21)、B_3和E_6 抗体特异性地识别分子量为17000道尔顿的TNF-α它们与rIL-1、rIL-2、rIFNγ、rIFNα、和E coli菌裂解液无交叉反应。竞争性ELISA结果证实7种抗体分别识别TNF-α分子上5个不同的抗原决定簇。其中4个抗体可以识别TNF-α活性中心部位。两个抗体还可以识别天然TNF-α分子。     

新型重组人肿瘤坏死因子治疗恶性腹水的临床研究

新型重组人肿瘤坏死因子（ｒｈ－ＴＮＦ）系经基因重组、结构改建的肿瘤坏死因子。本研究旨在探讨ｒｈ－ＴＮＦ和化疗药５－氟尿嘧啶（５－ＦＵ）和丝裂霉素（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ，ＭＭＣ）对恶性腹水的治疗效果，６４例恶性腹水分三组进行：Ｔ组（ＴＮＦ）２１例，ＦＭ组（５－ＦＵ，ＭＭＣ）１８例，ＴＦＭ组（ＴＮＦ，５－ＦＵ，ＭＭＣ）２５例。结果显示治疗恶性腹水的有效率分别为ＴＦＭ组９２．３％、Ｔ组８５．７％、ＦＭ组５０．０％。ＴＦＭ和Ｔ组较ＦＭ组疗效相差显著（Ｐ＜０．０１），ＴＦＭ和Ｔ组相差不显著（Ｐ＞０．０５），Ｔ组和ＴＦＭ组未见明显副作用。三组产生疗效的平均时间分别为ＴＦＭ组７．２ｄ、Ｔ组１１．５ｄ、ＦＭ组１８．２ｄ。表明ｒｈ－ＴＮＦ治疗恶性腹水具有疗效高，副作用小等优点。ｒｈ－ＴＮＦ和化疗药ＦＭ合用，可减少ＴＮＦ用量，缩短疗程，是治疗恶性腹水的理想方法。     

抗人重组肿瘤坏死因子β(rHTNF-β)单克隆抗体的研制及鉴定

肿瘤坏死因子β(TNF-β)是细胞毒性蛋白,与肿瘤坏死因子α(TNF-α)具有相似的生物学功能。为了进一步研究TNF-β的结构和功能,探讨TNF-β同TNF-α在生物学功能方面的相互关联,并且为纯化应用于临床的rHTNF-β提供技术手段。本实验应用脾内免疫杂交瘤技术制备了一株抗rHTNF-β单克隆抗体B5。Western blotting结果表明,B5特异地识别分子量为22kDa的TNF-β。B5和rHIL-1、rHIL-2、rHIL-6、rHIFN-γ、rHIFN-α、GM-CSF及E.Coli菌裂解液无交叉反应,B5培养上清与rHTNF-α有弱交叉,腹水在高浓度时有交叉反应。B5具有中和rHTNF-β细胞毒能力,亚类测定为小鼠IgG_1。     

肿瘤坏死因子突变体对胃癌细胞肿瘤坏死因子受体的调节

本文采用放射配基结合分析法和蛋白合成抑制试验研究了肿瘤坏死因子突变体（ＴＮＦ－ｍ）对ＳＧＣ７９０１细胞ＴＮＦ受体的影响。结果表明，ＴＮＦ－ｍ可显著降低ＳＧＣ７９０１细胞表面ＴＮＦ受体数目并呈剂量、时间、温度依赖关系，对受体亲和力无影响，ＴＮＦ－ｍ可使胞浆ＴＮＦ受体数目增加，去除ＴＮＦ－ｍ３ｈ后，膜ＴＮＦ受体大约可恢复６０％，显著高于胰蛋白酶处理组ＴＮＦ受体的恢复率，放线菌素Ｄ对ＴＮＦ－ｍ处理的细胞ＴＮＦ受体的抑制作用显著低于对照组，且ＴＮＦ受体的半衰期约为９０ｍｉｎ．据此认为，ＴＮＦ－ｍ通过介导ＴＮＦ受体的内化从而使膜ＴＮＦ受体数降低。     

Identification of a Strong Promoter of Bacteriophage MB78 that Lacks Consensus Sequence Around Minus 35 Region and Interacts with Phage Specific Factor

A strong promoter of bacteriophage MB78 does not have minus 35 consensus sequence although it has a TGn motif immediately upstream of minus 10 sequence as well as the AT rich UP element. It is efficiently recognised by the sigma 70 RNA polymerase, however, a phage-specific factor competes with sigma 70 RNA polymerase for binding to this region, the binding of the factor being stronger than that of the polymerase. Contrary to the reports in the literature the polymerase appears not to bind to the UP element whereas the phage-specific factor does. The latter seems to be involved in the regulation of the promoter activity. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

重组TFPI-2影响人卵巢癌细胞体外迁徙浸润能力的研究

目的 :从功能角度研究重组组织因子途径抑制物 2 (TFPI 2 )对人卵巢癌细胞体外迁徙、浸润能力的影响。方法 :①迁徙实验 ,加不同浓度TFPI 2培养的A2 780细胞和不加TFPI 2的A2 780细胞 ,通过Boyden小室体外浸润转移模型 ,以迁徙到聚碳脂微孔滤膜 (PVPF)背面的每高倍镜视野中的平均细胞数作为评价人卵巢癌细胞迁徙能力强弱的指标。②浸润实验在PVPF膜铺上基底膜基质胶 (Matrigematrix)后 ,行迁徙实验。结果 :①迁徙实验中 ,将A2 780 TFPI 2不同浓度组与A2 780对照组细胞穿过PVPF膜的细胞数进行比较 ,经t检验 ,没有统计学意义 (P >0 .0 5)。②浸润实验中 ,将A2 780 TFPI 2不同浓度组与A2 780对照组的细胞穿过人工膜的细胞数进行比较 ,及TFPI 2不同浓度组间的细胞数进行比较 ,经t检验 ,均有非常显著差异 (P <0 .0 1)。结论 :重组TF PI 2对人卵巢癌细胞体外自身运动能力无影响 ,但可显著抑制人卵巢癌细胞的体外浸润能力 ,为卵巢癌的蛋白酶抑制剂治疗提供一可能的靶向依据。