普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.     

普伐他汀对人I型胶原α1(I)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人I型胶原α1(I)链启动子活性的调控 ,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养。构建含人α1(I)前胶原基因5'侧翼序列 -2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞 ,CAT -ELISA测定普伐他汀对重组体的作用。结果设对照组的CAT值为1 ,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04 ,普伐他汀能明显抑制I型胶原α1(I)启动子的活性。结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(I)前胶原基因表达。     

细胞因子对小鼠α2（Ⅰ）型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的;探讨细胞因子对小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ⅰ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＦＮα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,     

人α2（I）型胶原基因启动子活性研究

目的 探索器官纤维化形成中调控I型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF－BB、IGF－1等细胞因子对其活性的影响。方法 从人α2（I）胶原基因转录起始点上游－2.4kb至＋58bp的片段中，取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的质粒组成5个重组体，转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞，测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性，同时加入细胞因子，以测定其对I型胶原启动序列的影响。结果 除－129～＋58bp序列外，其余4个重组体CAT表达水平均较高，其中－2292～＋58bp、－1476～ 58bp序列具较强启动CAT表达活性，－339～ 58bp、－616～ 58bp片段次之。TGF－β、IGF－1均能在一定程度上调人α2（I）胶原基因启动活性。结论 人α2（I）胶原基因片段－2292～ 58bp、－1476～ 58bp、－339～ 58bp有高启动活性，是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列。TGF－β、IGF－1促进胶原表达，与其上调胶原基因启动活性有关。     

人α2(Ⅰ)型胶原基因启动子活性研究

目的探索器官纤维化形成中调控Ⅰ型胶原基因高水平转录的启动片段及TGF-β、PDGF-BB、IGF-1等细胞因子对其活性的影响. 方法从人α2(Ⅰ)胶原基因转录起始点上游-2.4kb至+58bp的片段中,取长度不等的片段作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒组成5个重组体,转染上述重组体至正常人原代培养皮肤成纤维细胞,测定细胞CAT表达水平以比较各重组体的启动子活性,同时加入细胞因子,以测定其对Ⅰ型胶原启动序列的影响. 结果除 -129～+58bp序列外,其余4个重组体CAT表达水平均较高,其中-2292～+58bp、-1476～+58bp序列具较强启动CAT表达活性,-339～+58bp、-616～+58bp片段次之.TGF-β、IGF-1均能在一定程度上调人α2(Ⅰ)胶原基因启动活性. 结论人α2(Ⅰ)胶原基因片段-2292～+58bp、-1476～ +58bp、-339～+58bp有高启动活性,是进一步研究纤维化相关DNA结合蛋白的重要调控靶序列.TGF-β、IGF-1促进胶原表达,与其上调胶原基因启动活性有关.     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

目的研究TGF-β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因上游启动子活性的影响。方法以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT)作报告基因，应用基因转染技术研究小鼠胶原启动子活性。结果TGF-β可促进小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因启动序列的启动活性，而中药抗纤复方可明显抑制其启动活性。结论TGF-β和中药抗纤复方都可作用于胶原α2(Ⅰ)基因调控片段，进而促进或抑制胶原合成。     

细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性影响的研究

目的：探讨细胞因子对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子（－２ｋｂ～＋５４ｂｐ）为靶序列,将它与氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）报告基因组成的重组体ｐＡＺ１００９用脂质体法转染至胶原产生细胞ＮＩＨ／３Ｔ３细胞,讨论ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα对小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：ＴＮＦα抑制小鼠α２（Ｉ）型前胶原基因启动子活性,ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强这种抑制作用。结论：ＴＮＦα分别与ＩＦＮγ、ＩＦＮα联合应用能加强抑制作用,这可能与ＩＦＮγ、ＩＦＮα诱导ＴＮＦα受体表达,从而加强ＴＮＦα抑制作用有关,而ＩＦＮγ抑制胶原蛋白合成作用与该序列无直接相关。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

CCl_4诱导大鼠肝纤维化动物模型Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原生成变化的研究

目的探讨肝纤维化过程中胶原生成细胞的来源以及Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原基因及其蛋白表达的演变规律。方法利用免疫组化及核酸分子杂交技术，对ＣＣｌ４诱导ＳＤ大鼠肝纤维化不同阶段（２０周内）α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ的表达进行动态观察。结果（１）肝纤维化时α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ早期即迅速升高，α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ呈优势性表达，α１（Ｉ）前胶原ｍＲＮＡ含量的增加则较为缓慢；（２）肝纤维化早期，变性坏死区结蛋白阳性和α－平滑肌肌动蛋白阳性的Ｉｔｏ细胞及肌纤维母细胞表达α１（Ⅲ）、α１（Ⅳ）及α１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ。纤维化中、后期，三种前胶原ｍＲＮＡ表达主要见于间隔内纤维母细胞和肌纤维母细胞。结论二者构成肝纤维化时的主要胶原生成细胞。此外，窦内皮细胞也参与肝内Ⅳ型胶原的合成。     

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响

目的：研究ＴＧＦ－β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α２（Ｉ）基因上游启动子活性的影响。方法：以含小鼠胶原α２（Ｉ）上游０．４、０．８、２．０ｋｂ启动片段为研究靶序列,以氯毒素乙酰枯转移酶（ＣＡＴ）作报告基因,应用基因技术研究小鼠胶原启动子活性。结果：ＴＧＦ－β可促进小鼠前胶原α２（Ｉ）基因妄动序列的启动活性,而中药抗纤复方可抑制其启动活性。结论：ＴＧＦ－β和中药抗纤复方都可作用于胶原α２（Ｉ）基因调控     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

内皮素-1诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达

为研究内皮素-1(ET-1)对培养的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响,应用贴块法培养人胎儿肺动脉平滑肌细胞,应用免疫细胞化学染色、原位杂交方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA的表达.结果显示,加入含10-8mol/L ET-1的培养液培养48h和72h后,HPASMC Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及其蛋白表达明显增强.提示ET-1能够诱导培养的人肺动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加,其调控机制之一是在转录水平上增强了Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达.     

不饱和脂肪酸影响HepG-2细胞PAI-1表达的机制初探

目的：探讨不饱和脂肪酸对HepG-2细胞纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响及其机制。方法： 以发色底物法检测PAI-1活性，RT-PCR法检测PAI-1 mRNA水平；构建两个含不同片段缺失的PAI-1启动子序列控制表达的氯霉素转移乙酰酶（CAT）报告基因质粒，转染HepG-2细胞，ELISA法检测CAT表达量。结果： 油酸、亚油酸诱导下HepG-2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著高于对照组；共转染过氧化体增殖物激活型受体表达质粒（PPARα-pSG5）PAI-1转录活性显著增加；转染NF-κB样蛋白结合序列缺失的重组质粒，亚油酸诱导下PAI-1转录活性显著增加，而转染VLDL/脂肪酸反应元件缺失的重组质粒则无显著变化。结论： 不饱和脂肪酸增强HepG-2细胞PAI-1 mRNA表达及活性；PPARα可能是其上调PAI-1表达所涉及的转录因子之一，且VLDL/脂肪酸反应元件在该调控中具有重要作用，但可能并不涉及NF-κB信号转导途径。     

PGC-1α协同ERRα在人肝癌细胞中调节小鼠SHP转录

目的 检测PGC-1α和ERRα在人肝癌细胞（HepG2）中对小鼠SHP转录的影响,鉴定ERRα调节SHP启动子利用的顺式元件。 方法 在HepG2细胞和人胚肾细胞（293A）中瞬时转染ERRα和/或PGC-1α,双荧光酶报告基因实验检测小鼠SHP启动子的活性。构建5′删切和顺式元件突变的启动子报告基因,结合HepG2细胞中的双荧光酶报告基因实验,检测ERRα作用的结合位点。 结果 在HepG2和293A细胞中,共表达ERRα和PGC-1α能促进SHP转录。分析SHP启动子序列发现5个潜在的ERRα结合位点。通过删切启动子5′端,筛选出其中3个元件参与SHP的转录调节。进一步突变以上3个结合元件,鉴定到其中2个位点参与PGC-1α协同ERRα调节SHP转录的过程,另一个位点参与了SHP基本水平的转录。 结论 在HepG2 细胞中,除核受体FXR、ERRγ之外,发现,ERRα可以作为调节SHP基因转录的新途径,但需共激活因子PGC-1α同时存在。     

小鼠白蛋白基因启动子的克隆及其在不同细胞系中转录活性的检测

目的：对比小鼠白蛋白（mouse albumin promoter, ALB）启动子调控下的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）在不同细胞系中的转录活性。方法：以小鼠全血基因组DNA为模板,聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增ALB启动子序列,克隆至pEGFP-1中,构建重组体pALB-EGFP;在Lipofectamine介导下将pALB-EGFP、pEGFP-N1转染人胎肝细胞L02、人宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞SW480、人胰腺癌细胞Bxpc-3;荧光显微镜和流式细胞仪对各转染细胞中EGFP的表达进行检测。结果：pALB-EGFP构建成功;L02转染pALB-EGFP 72 h后,ALB启动子可起始EGFP的表达,转录活性为人巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子的1/4,其它转染细胞的ALB不能起始EGFP的转录;稳定筛选后,ALB的转录活性达到与CMV相当的水平。结论：构建的重组载体在肝脏来源细胞中具有较高的转录活性, 为建立肝脏特异性表达目的基因的转基因小鼠模型奠定了基础。     

细胞因子对HLA-B27启动子的调节作用及其在强直性脊柱炎发病机制中的意义

目的： 构建含HLA-B27启动子的HeLa稳定转染细胞株，观察7种细胞因子对HLA-B27启动子及其上游NF-κB及ISRE顺式作用元件活性的调节作用，探讨强直性脊柱炎（AS）等B27相关疾病的发生机制。方法:转染HeLa细胞，抗生素筛选单克隆构建含HLA-B27启动子的稳定转染细胞株。构建HeLa-B27稳定细胞株和HeLa-NF-κB稳定细胞株，在瞬时转染pISRE-luc的HeLa细胞中加入白细胞介素1α（IL-1α）、 白细胞介素1β（IL-1β）、 肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）、 干扰素γ（IFN-γ）和转化生长因子β（TGF-β），观察7种细胞因子对B27启动子及其上游NF-κB和ISRE作用元件的调节作用。另外在HeLa-B27 稳定细胞株培养液中同时加入3种细胞因子单克隆抗体和相应细胞因子，观察其对启动子活性的调节作用。结果:TNF-α、IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ 均能明显增强HeLa细胞B27启动子活性。细胞培养96 h 后，IFN-β为最强的启动子诱导剂（5.4倍，P<0.05）；细胞培养8 h 内，TNF-α、IL1-α 和 IL1-β,可诱导NF-κB的活性增加30倍左右（P<0.05），IFN-α 和IFN-β 可诱导ISRE的活性增加12倍左右（P<0.05），抗TNF-α 抗体对于I类IFN 增加的B27 启动子活性没有明显的抑制作用。结论：TNF-α和IFN 可通过结合于B27 启动子中各种转录因子结合元件调控HLA-B27启动子的转录活性，IFN-β 可能在强直性脊柱炎等B27 相关的脊柱关节病的发病机制中起着重要作用。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成的作用

目的探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成中的作用。方法将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为2组(1)对照组;(2)IGF-Ⅰ组培养液中加入终浓度分别为25、50、100、200μg/L的IGF-Ⅰ。用倒置显微镜观察细胞形态变化,以RT-PCR检测HK2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰα和胶原ⅢαmRNA表达的变化。ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅰ的浓度。结果IGF-Ⅰ刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形。不同浓度的IGF-Ⅰ作用于HK2细胞48h后,α-SMA、胶原Ⅰα和胶原ⅢαmRNA水平显著升高(P<0.05);ELISA结果显示,100及200μg/LIGF-Ⅰ组中HK2细胞分泌的胶原Ⅰ显著增加(P<0.05)。结论IGF-Ⅰ在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化,并促进其胶原的合成。     

低氧诱导肌成纤维细胞生成并通过ERK1/2途径促进Ⅰ型胶原的表达

目的：探讨低氧能否激活成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,以及低氧环境对肾皮质肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）的影响及其可能的信号通路。方法：（1）采用正常大鼠肾成纤维细胞系（NRK-49F），应用Western blotting方法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达;比较低氧和正常氧条件下α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白水平。（2）原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞，Western blotting方法检测低氧和正常氧条件下，HIF-1α和Ⅰ型胶原蛋白水平以及ERK1/2的活化及其特异阻断剂 PD98059的阻断效应；RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原mRNA表达水平；细胞免疫化学法检测HIF-1α胞内表达部位的变化；明胶酶谱法检测细胞上清中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP -9）的活性。结果：（1）低氧刺激6 h，NRK-49F细胞和肌成纤维细胞胞内和核内均有HIF-1α蛋白表达，核内更明显。（2）低氧培养12 h,NRK-49F细胞表达α-SMA蛋白明显增高，是正常氧组的187%±32%（P<0.05），验证了低氧可引起成纤维细胞表型转化。（3）低氧刺激原代培养的正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞6 h、12 h上清中Ⅰ型胶原蛋白水平增加，分别为正常氧组的171%±27%（P<0.05）和256%±61% （P<0.05）；低氧刺激4 h、6 h，Ⅰ型胶原mRNA表达增加，为正常氧组的189%±28%（P<0.05）和221%±44%（P<0.05）。（4）低氧刺激肌成纤维细胞6 h、12 h、24 h，培养上清液中MMP-9、MMP-2活性无明显变化。（5）低氧刺激肌成纤维细胞15 min 即可使ERK1/2活化，阻断实验显示，PD98059可以使低氧12 h引起Ⅰ型胶原增加（低氧刺激组为正常氧对照组的273%±51%，P<0.05)显著减少（PD98059 +低氧组为正常氧组的108%±19%，P>0.05)。结论： 低氧促肾纤维化可能与其诱导肾成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并经ERK1/2途径增加Ⅰ型胶原蛋白的表达有关。     

重组人TGF-β1对TGF-β1基因启动活性的影响

目的：探讨TGF-β1对人TGF-β1基因自身启动子活性的影响。方法：以人全血基因组DNA为模板，PER扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5′端-1328～ 812bp和 227～ 812bp的片段，以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因而不含启动子的pCAT-enhancer质粒构建成重组质粒，并将其转染至大鼠星状细胞株nFSC中，细胞在DMEM培养基中进行培养，用不同浓度的TGF-β1进行干涉，测定并比较细胞的CAT表达水平。结果：不同浓度的TGF-β1对大鼠的肝脏星状细胞的增殖具有抑制作用，而且这种抑制作用在实验用的浓度范围内具有剂量依赖关系；浓度为2．5ng/ml TGF-β1可以使转染phTGF0．585、phTGF1．120、phTGF1．423、phTGF1．680、phTGF2．140质粒的大鼠肝星状细胞的CAT活性分别增加2～5倍。结论：TGF-β1在大鼠nFSC细胞中对TGF-β1启动子活性具有自身促进作用，为进一步研究TGF-β1的调节机制提供了依据。