核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用

核酸分子杂交技术能特异地检测细胞及微生物的核酸序列，广泛地使用于肿瘤学、遗传学、病理学、微生物学、细胞学、流行病学的基础研究和临床诊断。核酸分子杂交的技术主要包括标本的处理、探针的制备和标记、杂交及杂交物的检测。     

异羟基洋地黄毒甙配基核酸探针检测血清HBV-DNA的临床应用

自从1985年我国引入放射性HBV-DNA分子杂交技术以来,为临床诊断乙型肝炎,判断HBV复制和评价肝脏病变及预后提供了感染HBV的直接证据和传染性指标。但放射性标记探针的敏感性受半衰期短的影响,加之价格昂贵,来源、运输、操作防护和废物处理等问题,难以普遍推广运用。本文运用较先进的非放射性标记的核酸探针,即异羟基洋地黄毒甙配基HBV-DNA探针(简称Dig-HBV DNA探针)做斑点杂交检测血清HBV-DNA,并参照~(32)P探针,从临床应用方面对其敏感性、特异性及重复性等做初步探讨。材料和方法一、标本与血清学试验:68份血清标本均来自本     

分子杂交化学发光法检测血清中乙型肝炎病毒DNA

目的：用非放射性的异羟基洋地黄毒甙（地高辛，Dig)标记探针与靶DNA杂交，结合化学发光检测系统检测乙肝患者血清中HBV DNA。方法：应用灵曼公司生产的Dig DNA标记检测试验盒。将Dig标记的HBV DNA探针与点印迹在尼龙膜或硝酸纤维素膜上的靶DNA杂交，杂交后的膜与Dig－AP抗体保温，然后用化学发光底物CSPD与之作用，导致在波长477nm处发光，感光于X光底片上。结果：待检的129份血清标本，用此法检测HBV DNA阳性率达58．4％，敏感性2.0pg-0.5pg。为了比较，329份血清标本用显色法测定，阳性率45．0％，敏感性5.0pg-1.0pg。对照组呈阴性结果。结论：Dig标记探针分子杂交化学发光法具有较高特异性，敏感性和简便等优点，可用于血清中HBV DNA的检测。     

核酸探针在结核病实验室诊断中的应用进展

核酸探针杂交技术在结核分枝杆菌的分子生物学研究、细菌分类与鉴定、流行病学调查等方面具有十分重要的作用。本文综述了同位素标记核酸探针（包括全染色体探针、克隆重DNA片段探针、cDNA探针）和非同位素标记核酸探针（包括AP－DNA探针、AAF－DNA探针、AE－DNA探针、Dig－DNA探针）在结核病实验室诊断中的应用进展。     

核酸探针在结核病实验室诊断中的应用进展

核酸探针杂交技术在结核分枝杆菌的分子生物学研究、细菌分类与鉴定、流行病学调查等方面具有十分重要的作用。本文综述了同位素标记核酸探针（包括全染色体探针、克隆重ＤＮＡ片段探针、ｃＤＮＡ探针）和非同位素标记核酸探针（包括ＡＰ－ＤＮＡ探针、ＡＡＦ－ＤＮＡ探针、ＡＥ－ＤＮＡ探针、Ｄｉｇ－ＤＮＡ探针）在结核病实验室诊断中的应用进展。     

16S～23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针不同显色方法对结核患者痰标本的检测

目的：评价16S－23rDNA间隔区序列寡核苷酸探针碱性磷酸酶显色与辣根过氧化物酶化学发光学对结核患者痰标本检测的应用价值。方法：采用生物素标记5′端18bp的寡核苷酸探针斑点杂交的碱性磷酸酶显色反 辣根过氧化物酶化学发光检测90例例结核患者和30例非结核患者痰标本,结果：痰标本基因组DNA直接与探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为22．2％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为33．3％,痰标本经引物PL1、PL2扩增（扩增产物350bp,）与寡核苷酸探针杂交,碱性磷酸酶显色反应检测阳性率为77．8％,辣根过氧化物酶化学发光检测阳性率为83．3％,痰标本经引物b扩增（扩增产物250bp)与探针杂交,碱性磷酸酶显色和化学发光检测阳性率分别为75．6％,80．0％,检测的敏感性高于痰涂片。寡核苷酸探针与30例非结核患者痰标本DNA杂交则全为阴性。结论：寡核苷酸探针和250bpPCR扩增产物相结合,经化学发光显色是分枝杆菌检测的一种有效方法。     

恶性淋巴瘤的基因诊断

恶性淋巴瘤的诊断与分类迄今仍为肿瘤病理学难题之一。尽管免疫组化已在这方面提供了很大的帮助,但还难于决定某些特殊的恶性非何杰金氏病淋巴瘤的细胞来源。且一些淋巴细胞增生性疾患,可能不易区分其良恶性。近年,随着分子生物学的发展,核酸分子杂交技术的出现与改进给淋巴瘤的诊断带来了生机。所谓分子杂交技术就是用DNA(或RNA)探针根据碱基互补的原则,与细胞中游离DNA分子发生杂交反应,籍以检测病变组织中的基因改变。它的特异性和敏感性都高于传统免疫学的杭原——抗体反应。起初DNA(或RNA)探针是用同位素标记,Southern(或Nout-hern)印迹法检测。此法耗资大、费时多,临床应用     

直接杂交法检测痰液中结核分枝杆菌

目的 建立了一种高度灵敏、特异、快速和简便的探针杂交检测技术，以解决临床上结核病快速诊断的难题。方法 采用简易的方法处理标本，以对结核分枝杆菌特异的生物素标记188bpDNA探针进行点杂交，与链霉亲合素标记的辣根过氧化酶偶联后，以化学发光自显影方式记录检测信号。结果 此法的第三性可检出200个菌，较PCRI地为高，对20种分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测时发现只有结核分枝杆菌呈阳性，以本法检测104例临床标本。结果发现，对其中45例结核病人痰涂片阳性标本。41例结核病人痰涂片阴性标本和18例非结核标本。检测阳性率分别为100%、65.9%和0.0%。结论 本法简便，特异。     

化学发光在核酸探针诊断中的应用及其进展

本文论述了三种化学发光反应在核酸探针诊断中的应用:以鲁米诺增强的化学发光反应为基础的探针检测,新型的碱性磷酸酶发光底物AMPPD 的应用以及用吖啶酯标记的发光探针进行的核酸杂交保护分析及其应用。     

应用非放射性分子杂交方法检测HBV-DNA的体会

非放射性分子杂交是近几年发展起来的一种新技术。它分为固相杂交、液相杂交和原位杂交三种。其中固相杂交最为常用。非放射性分于杂交克服了放免同位素污染环境，半衰期短和需要特殊仪器的缺点，因而它能在基层迅速推广使用。我站自1990年以来采用非放射性分子杂交法检测HBV-DNA，取得满意效果。现将我们的体会介绍如下，供同道参考。     

电化学发光分析及其在核酸测定中的应用

电化学发光（ECL）分析是新近发展起来的既不同于传统的标记免疫分析（如酶标记、同位素标记、荧光素标记等）也与普通的化学发光有区别的一种新型检测方法，它将电化学法和化学发光法巧妙结合，具有灵敏、快速、准确、分析适应性广等特点。本文综述了ECL的原理、特点及其在核酸定量检测中的应用。核酸的杂交分析和聚合酶链反应（PCR）等技术已广泛应用于分子生物学的实验研究和临床诊断领域。根据核酸探针或反应体系中所用的示踪剂不同，核酸分析可分为放射性同位素法和非放射性同位素法如免疫荧光法、时间分辨荧光法、化学发光法、生物发光法等。90年代初期问世的将电化学（electrochemistry）和化学发先（chemiluminescence）完美结合的新型免疫分析技术电化学发光技术（electrochemiluminesence，ECL），同时联合新型的免疫固相放大技术──链霉亲和素系统，在免疫学检测中尤其是核酸测定中，发挥了以往的发光技术无可比拟的优势［1］，本文拟就ECL的原理，分析特点及核酸测定中的应用作一简要综述。     

核酸杂交技术在乙型肝炎病毒诊断中的应用

近年来,随着分子生物学的迅速发展,一些先进技术如核酸杂交技术已逐步用于对人类病毒性疾病的研究。核酸杂交技术具有敏感,快速、特异性强等优点。它不仅可以检测游离的病毒核酸,分析整合乎细胞的病毒核酸序列,还可进行病毒核酸定量。有些疾病只有检测患者体内是否保留病毒基因才能证实是否感染该病毒时,更具有重要的意义。核酸杂交技术建立在硷基互补基础之上。因此,制备高度特异性及高标记活性的探针(Probe)是关键所在。获得病毒核酸     

探讨FISH技术在TCT收集宫颈脱落细胞中的应用

荧光原位杂交(fluorescence in hybridization,FISH)是一种快速、有效的分子细胞遗传学技术.采用荧光标记的特异核酸序列,根据探针与被检测样本中核酸序列的互补性,探针与样本核酸杂交后,在荧光显微镜下检测荧光信号,从而对样本中待测核酸进行定性、定位与定量分析[1].本研究应用FISH技术探讨hTERC(即人染色体末端酶)基因在宫颈脱落细胞的表达.     

Digoxigenin—11—dUTP标记寡核苷酸探针及化学发光检测

非放射性标记探针的应用，对于推广基因分析技术有重要意义。本文介绍一种新颖，简单，快速，灵敏的非放射性遗传变异分析技术－Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ标记寡核苷酸探针，并用化学发光法检测。表明此标记方法可以满足基因分析的需要。     

液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用

目的采用液相杂交技术,简化核酸杂交过程,建立乙肝病毒（HBV）的液相杂交的聚合酶链反应-酶联免疫检测（PCR-ELISA）方法。方法将5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃2min,55℃1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件优化探针浓度3pmol/次,酶标记抗体稀释度1∶1000。液相杂交时间3min,固相杂交时间120min,但其检测结果无明显差别。检测灵敏度1×10     

PCR法标记探针在核酸杂交中的应用

目的　建立一种简便、高效的核酸探针标记方法。方法　以扩增小鼠生精细胞凋亡相关基因时使用的引物 ,基因重组扩增后阳性克隆质粒DNA为模板 ,采用PCR法标记同位素 [α 3 2 P]dCTP。结果　制成的探针比放射活性大于 1× 10 9cpm/ml,电泳仅见一条条带 ;northernblot杂交显示阳性条带清晰 ,背景噪音低。结论　PCR法标记探针简便、特异、高效     

用核酸探针诊断人病毒病

用核酸探针诊断人病毒感染是重组DNA技术的最新发展,用这种方法可以分析插入病毒序列,作病毒核酸定量和病毒的分子流行病学研究。杂交方法还可用于病毒的致病性研究,特别是在过去,病毒基因组仅作为病毒后天性感染证据时。原位杂交可以检测组织切片中特异细胞内的病毒核酸。杂交的特异性和速度表明,这种方法是目前使用的常规方法的重要补充,如易感细胞感染和病毒在组织培养中生长,标本的电镜检查以及用免疫荧光、免疫酶结合物、放射免疫测定、ELISA和血清学方法检查病毒抗     

串联重复序列信号放大液相杂交检测HBV-DNA技术的建立及评价

目的 建立串联重复序列信号放大(TRSE)液相杂交系统检测HBV-DNA技术,并初步评价其效果。方法 在前期研究构建的含24个60 bp串联重复核酸片段的重组噬菌粒中,插入4个HBV DNA片段而构建成一级检测探针,并结合12个串联重复的二级放大探针和标记的三级探针,建立检测HBV DNA的TRSE液相杂交系统。采用含HBV全基因组的重组质粒DNA对355份肝炎患者或正常人群的血清样本进行检测,评价该系统的效果。结果 在检测探针的一侧插入HBVDNA片段后,建立了HBV DNA的TRSE液相杂交检测系统。检测含HBV全基因组的重组质粒DNA的敏感性为8.33×104拷贝/ml。检测血清样本时,可区分HBeAg阳性与阴性患者间的HBV DNA水平差异。结论 TRSE液相杂交检测HBV DNA系统具有较好的敏感性、特异性和实用性。串联重复核酸序列信号放大的模式具有进一步开发利用的价值。     

量子点标记荧光原位杂交法在快速检测金黄色葡萄球菌中的应用

目的:应用量子点标记的荧光原位杂交方法以快速检测金黄色葡萄球菌。方法:采用两种量子点-亲和素-生物素-DNA探针,即A型肠毒素(SEA)基因与FemB基因探针与金黄色葡萄球菌临床分离株或感染金黄色葡萄球菌的粪便标本进行荧光原位杂交,同时与SEA基因聚合酶链反应(PCR)的检测结果比较。结果:10株临床金黄色葡萄球菌分离株中,2株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阳性,其余8株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阴性,10株FemB基因探针杂交结果均为阳性。3例分离培养为金黄色葡萄球菌的临床粪便标本直接进行荧光原位杂交,FemB及SEA基因探针杂交结果均为阳性,SEA基因PCR检测结果均为阳性。SEA、FemB基因探针与其他相关菌种未见非特异性反应。结论:量子点标记荧光原位杂交法检测金黄色葡萄球菌具有快速、简便、特异的特点,且可用于临床粪便标本的直接检测。     

临床基因诊断实验室的管理

一　技术背景在基因诊断技术发展史中核酸分子杂交发展最早 ,于 196 1年开始研究。最经典的方法是Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法 ,主要用于ＤＮＡ的检测 ;随后又发展出了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法 (检测ＲＮＡ)和斑点杂交法等。它是直接对样品中靶序列的测定。杂交法灵敏度不够 ,据报道最敏感的核酸探针仅能检出 10 3～ 10 4 拷贝的靶分子 ,而多数临床标本中靶分子量远低于此限。 1980年代中期 ,以ＰＣＲ技术为主的体外核酸扩增技术的发展 ,使低拷贝临床标本的检测成为可能。ＰＣＲ能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增 10 5～ 10 7倍 ,将检测…