小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的： 构建重组人HIF-lα 真核表达质粒,为进行人HIF-lα基因的克隆与表达做准备。 方法： 从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA。分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA 为模板,加入所设计的3对引物［EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物］所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒。测序正确后经酶切先后克隆进入pVAX1载体。 结果：通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同。将以上3个片段依次连入pVAX1载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp　片段,与预想结果一致。结论：成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAX1-EGFP-linker-HIF-1α。     

CEA迷你基因串联体肿瘤疫苗的构建

目的：构建人癌胚抗原（CEA）的迷你基因串联体肿瘤疫苗。方法：通过PCR从人基因组中得到一段来源于CEA的DNA序列,其中包含两个编码辅助性T细胞（HTL）表位的迷你基因,插入pGEM-T easy载体后测序,再将目的基因以同尾酶连接的方式顺次定向亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.0中,得到三串联体,以 PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒 pc DNA3.0-triCEA_625-667。结果:PCR和酶切结果表明,获得的目的基因与所选的基因片段 CEA_625-667中包含的碱基数量吻合,且带有正确的酶切位点。测序结果与GenBank登记完 全相同。构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的经同尾酶连接的目的基因片段三倍体。结论：成功地构建了含有CEA_625-667基因三串联体的DNA疫苗。     

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法扩增人转化生长因子基因，与GFP真核表达载体连接，构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体，并用限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序，证实新质粒的构建成功。结论：应用RT-PCR方法扩增目的DNA片段，简单快捷；双酶切定向克隆可以保证构建一步到位，免去正反向重组体筛选的问题。     

重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体的构建及其表达

目的 构建重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.方法 以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin.以pGEM-T/tumstatin为模板扩增含Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段,sig-tumstatin 片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tum-statin基因片段及重组载体进行验证.将重组sig-tumstatin 真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测.结果 所获得的sig-tumstatin片段(822 bp)序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含重组人肿瘤抑素的pIRESneo3/sig-tumstatin表达载体构建成功.转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin的CHO-K1分泌表达了重组人tum-statin.另外,从生长曲线结果来看,转染了 pIRESneo3/sig-tumstatin真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢一些.结论 成功地构建了重组人tumstatin分泌型真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础.     

肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体构建及鉴定

目的构建肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体.方法提取人肝癌组织总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因cDNA序列,经与pMD18-T simple载体连接,筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的BC047440基因cDNA序列反向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS.结果经RT-PCR获得826 bp含限制性内切酶位点的cDNA片段,T载体克隆后经PCR扩增目的片段、测序,确定该片段为BC047440基因cDNA,进而构建反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,并经PCR扩增目的片段,测序确证.结论成功构建了BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,为进一步研究该基因功能奠定了基础.通过抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织间差异表达基因进行分离、鉴定,我们发现了1条新的肝癌相关基因cDNA片断(EST)[1],长447 bp,经GenBank检索,90%与已知基因无同源性.进一步采用RACE技术,克隆出该基因的全长cDNA序列[2].经GenBank检索,与近期登录的基因BC047440同源.但该基因是从大脑组织中获得[3],而且国内外少见该基因功能研究的报道.在此基础上,本研究从原发性肝癌组织中克隆了BC047440基因的全长cDNA序列,并构建了其反义RNA真核表达载体,为进一步研究该基因功能奠定基础.     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

RNAi真核表达载体上报告基因的构建及其在人结肠癌HCT-8细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白报告基因的pSilencer3.1-H1真核表达载体,并转染真核细胞稳定表达,为进一步应用于RNAi相关研究奠定了基础。方法:应用PCR方法从pEGFP-C1标准质粒中获得GFP基因片段,在克隆载体中鉴定、测序;用DNA重组技术将片段定向插入RNAi常用载体pSilencer3.1-H1质粒中,构建pSilencer3.1-H1/GFP重组表达载体,经PCR及酶切鉴定后,通过脂质体介导转染HCT-8真核细胞;荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达。结果:真核表达载体pSilenc-er3.1-H1中正确插入了GFP基因片段,并在人结肠癌HCT-8真核细胞中稳定的表达。结论:成功构建了pSilencer3.1-H1/GFP真核表达载体。     

单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B基因疫苗的构建及其诱导小鼠细胞免疫应答

目的:构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗，检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法:利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14～507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA₃载体中，构建出重组真核表达质粒pcDNA₃-gBt，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次，抗体分析CD4⁺、CD8⁺T细胞亚群的变化，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)/碘化丙碇(PI)双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果:PCR及测序鉴定结果显示，插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致，证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建；pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4⁺T细胞数较空质粒（pcDNA₃）对照组和生理盐水对照组增加，CTL活性也较对照组明显增强，但是pcDNA₃-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8⁺T细胞、CD4⁺/ CD8⁺T细胞比值与对照组比较差异均无显著性（P＞0.05）。结论:HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。