肾脏移植早期T细胞受体Vβ链CDR3克隆谱系分析

目的探讨肾脏移植患者早期(第1个月内)外周血单个核细胞(PBMC)来源的T细胞受体Vβ链CDR3区(TCR VβCDR3)克隆扩增分析。方法收集10对肾脏移植受者及供者外周血分离PBMC并提取DNA。使用HLA-ABDR配型试剂盒检测其HLA-ABDR分型,分析配型情况。收集肾脏移植患者移植前和移植后早期PBMC,并提取RNA后逆转录成cDNA,使用TCR VβCDR3特异性引物,扩增TCR并测序和分析克隆扩增情况。最后,对克隆扩增的TCR VβCDR3片段序列进行比较分析。结果检测和比对了10对肾脏移植受体和供体的HLA-ABDR分型。移植患者移植前未发现TCR克隆扩增现象;而与此相比,移植后早期不同时间(第7、14、28天)均发现单克隆或寡克隆扩增。克隆扩增的TCR VβCDR3氨基酸基因片段部分序列有重复出现现象。结论肾脏移植患者早期外周血TCR VβCDR3出现克隆扩增可能与移植相关。本研究为今后肾脏移植配型以及免疫排斥反应的防治提供参考。     

1例CD3ε缺陷致重症联合免疫缺陷病的临床及免疫学特征分析

目的探讨1例由11q23染色体CD3E基因突变导致CD3ε缺陷重症联合免疫缺陷病的临床特征及免疫表型。方法收集近期就诊于重庆医科大学附属儿童医院的1例疑诊CD3ε缺陷致重症联合免疫缺陷病患儿外周血标本,提取外周血单个核细胞(PBMC)及核酸,CDR3扫描谱型技术分析T淋巴细胞受体(TCR)多样性,定量PCR检测TCR重排剪切环(TREC)含量,二代测序筛查免疫相关基因,一代测序验证。结果 TCR Vβ亚家族表现为单克隆或寡克隆峰,提示TCR重组受限;定量PCR未检测到TREC含量提示TCR重组及T细胞胸腺输出严重受损;二代测序显示CD3E基因复合杂合突变,一代测序验证证实。结论通过临床及免疫学分析、二代测序筛查及一代测序证实,确诊1例CD3E基因复合杂合突变致CD3ε缺陷重症联合免疫缺陷病,该病例罕见且临床与免疫学表型复杂,临床诊断存在困难,导致漏诊与延迟诊断,患者死亡率高且均为早期死亡,干细胞移植或基因治疗是其唯一的根治手段,因此提高临床工作者对本病的认识对于早期诊断与针对性治疗至关重要。     

APL相关TCRVα6、Vα10和Vβ23寡克隆T细胞CDR3序列分析

目的:分析急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周m TCR Vα和Vβ克隆性增殖T细胞及CDR3序列特点.方法:利用RT-PCR法扩增1例APL患者外周血单个核细胞中29个TCR Vα基因和24个Vβ基因CDR3,阳性PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析确定其CDR3长度,了解其克隆性;寡克隆的PCR产物再进行CDR3区序列分析.结果:该例APL患者外周血T细胞分别在TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族中出现寡克隆性增殖T细胞,经序列分析显示TCR Vα6、Vα10和Vβ23亚家族基因序列分别为Vα6NJα17、Vα10NJα35和Vβ23NDβ1NJβ2.7,其CDR3区氨基酸序列分别为CAMRENSAGNK,YLCAGDELLWECA,CASSSKWAG-GTYEQY,该3个TCR基因已被GenBank收录(登陆号:EU544946、EU544947和EU647219).结论:APL患者外周血T细胞出现的TCR Vα6、Vα10和Vβ23克隆性增殖T细胞可能是机体对抗白血病细胞所引起的抗原特异性免疫反应;这3个独特TCR重排序列将进一步作为开展APL特异性免疫治疗研究提供资料.     

活动性肺结核患者α/β TCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/β TCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/β TCR基因重排特点及CDR3谱型.方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和β TCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列.结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列.α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主.同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列.结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法.结核患者病变局部克隆性增殖的TCR α和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性.     

强直性脊柱炎患者外周血TCR Vα CDR3谱系基因扫描分析研究

目的:探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3(TCR Vα CDR3)谱系多态性,为AS的免疫发病机制的研究提供实验基础。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增34个TCR Vα亚家族,经免疫扫描谱型技术分析AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TCR Vα CDR3的谱系漂移情况。结果:5例正常健康对照PB-MC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布。所有AS患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括:单峰、寡峰/寡峰趋势、偏峰和不规则异常峰型。34个TCR Vα亚家族中,共有17个亚家族在少数患者中的扫描谱型呈单峰即单克隆增生。结论:AS患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性,表明T细胞在AS免疫发病机理中扮演重要角色。单/寡克隆增生的T细胞有可能是AS发病中的自身反应性T细胞,将为AS的发病机制的进一步研究提供基础依据。     

直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞中T细胞受体基因谱型特征

目的 分析直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor—infiltrating lymphocytes，TIL)克隆的TCRβ基因谱型及CDR3区氨基酸序列，了解直肠癌TIL抗肿瘤细胞克隆的基因特征。方法 采用RT—PCR方法扩增直肠癌肿瘤组织、术前外周血和术后外周血T淋巴细胞TCTβ基因的24个不同V基因片段，经过特殊的测序凝胶分离和银染色后，确定它们的TCRβ基因表达谱型。通过对PCR产物直接测序的方法，分析克隆性增殖的特征和CDR3区氨基酸序列。结果 直肠癌肿瘤组织TIL的TCRβ基因谱型中具有克隆性表达，表明直肠癌TIL是呈寡克隆性增生的淋巴细胞；来自2例不同患者的肿瘤组织TIL中单克隆性表达的TCRβV11基因具有安全相同的DNA和氨基酸序列；其余四个寡克隆的CDR3区存在共同保守的氨基酸序列G／xGGN／xY（D）EQ，这些序列可能直接接触直肠癌肿瘤组织相关抗原。结论 直肠癌肿瘤组织TIL细胞中存在特异性识别肿瘤相关抗原肽的T淋巴细胞克隆。     

DLI治疗CML病人的克隆性增殖TCR Vβ细胞分析

目的：了解供者淋巴细胞输注（DLI）后,产生GVL效应的克隆性TCR Vβ亚家族T细胞的情况。方法：利用RT－PCR分别扩增2例CML经allo-BMT后复发病人DIL治疗前后不同时间外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。阳性的PCR产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析产物的CDR3长度,了解T细胞克隆性。结果：DLI治疗前病人外周血仅表达4－11个Vβ亚家族,而DL1治疗后缓解期则可检测到12－21个Vβ亚家族。基因扫描显示DLI后病人外周出血某些新的Vβ亚家族克隆性增殖T细胞。结论：病人的TCR Vβ亚家族T细胞存在倾斜性分布现象,该倾斜现象在完全缓解时逐步恢复正常。DLI治疗病人时,可能通过某些克隆性增殖TCR Vβ亚家族T细胞而发挥GVL作用。     

抗病毒治疗对CHB患者外周血TCRβ链CDR3谱系的影响

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒治疗前后T淋巴细胞受体(TCR)β链各家族互补决定区3(CDR3)谱系的变化,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化。方法:采用荧光定量PCR(FQ-PCR)溶解曲线法对11例CHB患者抗病毒治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)T淋巴细胞受体β链可变区(TCR BV)基因各家族CDR3谱系进行分析,了解抗病毒治疗前后T细胞应答的变化。分析TCR CDR3谱系与CHB患者血清病毒载量的关系。结果:11例CHB患者抗病毒治疗后多个TCR CDR3谱系均出现了不同程度偏移。低病毒载量组(HBV DNA≤104拷贝/ml)治疗后谱型偏移率显著高于高病毒载量组(HBV DNA≥105拷贝/ml)。结论:CHB患者抗病毒治疗后单寡谱型偏移率与治疗前血清HBV DNA的水平相关。     

葡萄膜炎患者外周血TCR Vα谱系多态性分析

目的 探讨葡萄膜炎患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3 (TCR Vα CDR3)谱系特点及多态性.方法 采用RT-PCR扩增葡萄膜炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中TCR Vα 34个亚家族,经免疫扫描谱型技术分析34个亚家族谱型.结果 5例正常健康人PBMC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布,4例葡萄膜炎患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括单峰、寡峰/寡峰趋势,偏峰和不规则异常蜂型.34个TCR Vα亚家族中,不同亚家族异常峰型出现的频率不同,非正态异常峰型出现频率较高的亚家族有Vα13和Vα17(均为3/4),而Vα1.1、Vα10、Vα20、Vα28和Vα28亚家族均未出现异常峰型.TCR Vα7在HLA-B27阴性的患者(U2)中出现异常峰型,在HLA-B27阳性的3个患者(U1、U3、U4)中并未出现这个亚家族的异常;TCR Vα13则相反,即在HLA-B27阳性的3个患者中均出现异常峰型,而在HLA-B27阴性的患者中正常.结论 葡萄膜炎患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性特点,单/寡克隆增生的T细胞有可能是葡萄膜炎发病中的自身反应性T细胞.     

霉酚酸酯治疗GVHD及其分子机制的初步研究

初步探讨霉酚酸酯(MMF)治疗GVHD的分子机制。采用MMF每日1～2g,并应用RT-PCR扩增3例GVHD患者MMF使用前后外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族的CDR3,了解患者TCR VβT细胞的分布情况。结果表明,患者在GVHD发生前,有TCR Vβ3及其他亚家族基因表达,MMF治疗后,GVHD得以缓解,Vβ3不表达;当患者GVHD复发时,Vβ3基因又表达,治疗后不表达。MMF作用的分子机制可能与抑制TCR Vβ亚家族基因表达有关,TCR Vβ3可能是MMF作用的靶基因。     

T-ALL及T细胞株相关TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的了解T细胞-急性淋巴细胞白血病(T-ALL)患者外周血中的T细胞及T细胞株的TCR Vβ基因谱系及其克隆性增殖情况。方法利用RT-PCR方法扩增6个不同的T细胞株和6例初发未治T-ALL病人外周血单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3(CDR3)，PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性，部分T细胞株的单克隆PCR产物进一步进行序列分析。结果与正常人外周血表达全部24个Vβ亚家族不同，6例T-ALL病人分别表达5～12个Vβ亚家族。6例病人均存在1个或多个Vβ亚家族的寡克隆或双克隆增殖T细胞，另外，还有一些Vβ亚家族多克隆模式发生改变，呈现寡克隆性增殖的趋势。T细胞株多显示为表达一个Vβ亚家族的单克隆T细胞，不同T细胞株的CDR3长度和序列不尽相同。结论T-ALL患者外周血T细胞的TCR Vβ谱系出现限制性改变，均可检测到克隆性增殖T细胞，尚需进一步鉴定其性质(肿瘤性或抗原特异性增殖)，对于检测微小残留病变和设计抗白血病独特型疫苗均有一定的意义。     

T细胞TCR CDR3受体库的高通量测序分析概况

T细胞是机体免疫功能的执行者,T细胞受体(TCR)是T细胞表面识别抗原的分子,也是T细胞产生免疫应答的第一个关键分子。TCR由胚系基因于胸腺中进行V(D)JC基因重排而形成,发育成熟的T细胞迁移至外周组成多样性的T细胞库,其中最能代表T细胞应答特征的分子为TCR高变区CDR3,在外周形成一个多样性的T细胞CDR3受体库(rep-ertoire),对TCR CDR3受体库研究,将为T细胞生理和病理特征的全面解析提供基础。     

T细胞抗原受体β链互补决定区3受体库高通量测序分析及其在重要疾病中的研究应用

T细胞受体(TCRs)既是T细胞特异性识别和连接抗原的分子,也是T细胞发生免疫应答的关键分子.其中TCR高变区的CDR3变异最大,最能代表T细胞的应答特征,其在外周形成了具有多样性的T细胞CDR3受体库.因此,对T淋巴细胞β链CDR3组库的研究,以期更好地理解疾病的发病机理,并对疾病的临床诊断和治疗、监测疾病提供理论基础和新的思路.     

白血病异基因造血干细胞移植后TCR Vβ亚家族基因谱的研究

目的：了解白血病病人异基因外周血干细胞移植后1年以上患者TCR VβT细胞免疫功能重建的情况，方法，采用RT－PCR扩增5例CML和1例AML－M3a移植后（12－56个月）患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因，分析其TCR Vβ亚家族的表达。结果：经24个Vβ引物所分别进行的RT－PCR检测TCRVβ各亚家族基因的表达情况，发现6例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同，病人的部分Vβ亚家族T细胞仍款能重建，仅表达5－22个亚家族基因。结论：移植后1年以上患者尽管CD3＋T细胞已恢复，但外周血TCR Vβ亚家族基因谱的表达仍不完全，T细胞免疫功能仍未完全重建。     

白血病患者异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的研究

目的通过分析TCR Vβ基因片段选择性扩增,了解白血病患者异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞的免疫重建及其在移植物抗宿主病(GVHD)患者中的表达特点.方法采用RT-PCR扩增10例移植后患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ 24个基因片段,分析其TCR Vβ基因的表达情况,GVHD患者的PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性.结果经24个Vβ引物所分别进行的RT-PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况,发现 10例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同,病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建,仅表达5～22个亚家族基因;9例GVHD患者外周血仅表达2～8个TCR Vβ亚家族,其中7例均表达Vβ3.对6例GVHD患者的基因扫描显示,均存在克隆性T细胞生长.结论移植后病人外周血淋巴细胞TCR Vβ基因片段部分受抑制,部分基因片段呈选择性扩增.GVHD患者有Vβ3和Vβ8基因的优势表达,并有克隆性T细胞生成.     

白血病患者异基因造血干细胞移植后T细胞免疫重建的研究

目的 通过分析TCR Vβ基因片段选择性扩增，了解白血病患者异基因外周血干细胞移植后T淋巴细胞的免疫重建及其在移植物抗宿主病(GVHD)患者中的表达特点．方法 采用RT—PCR扩增10例移植后患者外周血的单个核细胞的TCR Vβ24个基因片段，分析其TCR Vβ基因的表达情况，GVHD患者的PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性．结果 经24个Vβ引物所分别进行的RT—PCR检测TCR Vβ各亚家族基因的表达情况，发现10例病人外周血与正常人表达24个Vβ亚家族有明显的不同，病人的部分Vβ亚家族T细胞仍未能重建，仅表达5-22个亚家族基因；9例GVHD患者外周血仅表达2—8个TCR Vβ亚细胞生长．结论 移植后病人外周血淋巴细胞TCR Vβ基因片段部分受抑制，部分基因片段呈选择性扩增．GVHD患者有Vβ3和Vβ8基因的优势表达，并有克隆性T细胞生成．     

HBsAb滴度高于10000mU/ml外周血BCR CDR3受体库的组成及特征分析

目的:分析HBs Ab滴度10 000 m U/ml外周血BCR CDR3受体库的组成及特征,寻找可能的HBs Ab序列,为维持后续研究提供数据基础。方法:提取HBs Ab滴度高于10 000 m U/ml样本的PBMC总DNA,外送美国Adaptive Biotechnologies Immuno SEQ平台行Illumina Solexa高通量测序,用IMGT数据库中的High V-QUEST软件初步分析BCR CDR3受体库IGHV、IGHJ和IGHD基因亚群的分布情况、IGHV-J配对取用情况、CDR3区氨基酸长度分布及氨基酸取用情况,并与NCBI数据库中HBs Ab序列进行比对。结果:实验样本均高频取用基因亚群IGHV3、IGHV4,IGHJ4、IGHJ6,IGHD3、IGHD6;高频取用配对IGHV3-J4、IGHV3-J6。CDR3区氨基酸长度均以14及15个氨基酸长度为中线呈正态分布,高频取用的氨基酸依次为Y、G、D、A、R、S,在107、108、109、113、114位点呈现氨基酸多样性取用,在105、106、115、116、117位点上取用氨基酸保守。与NCBI数据库中HBs Ab序列比对,得到IGHV、IGHJ、CDR3氨基酸长度完全一致的独特序列共48条。结论:HBs Ab滴度高于10 000m IU/ml样本BCR CDR3受体库的组成具备基本一致的特征,获得的48条独特序列为维持后续研究提供了坚实的数据基础。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化的研究

目的:分析慢性乙型肝炎(CHB)患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族克隆化特征。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增8例CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果:基因扫描显示所有8例CHB患者CD8+T细胞TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生。Vβ8、Vβ11、Vβ12出现单克隆增生的频率相对较高。8例健康者TCR Vβ基因亚家族均为多克隆。结论:CHB患者外周血CD8+T细胞TCR Vβ亚家族存在克隆性增生。     

监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定

外周血95％ T淋巴细胞的TCR由α（胚系基因中AV、AJ、AC重排）、β（胚系基因中的BV、BD、BJ、BC重排）两条多肽链组成，不同V（D）J重排后，由V基因末端、J基因前端和V-J（或V—D和D—J）连接时中间插入的核苷酸序列，分别组成了特异的TCRα和8的CDR3基因谱型的多样性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆，测定特定CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度和功能状态。     

BCR组库分析乙肝疫苗接种反应及初步机理分析

目的接种乙肝疫苗是控制乙肝流行最经济有效的方法,通过对3次乙肝注射疫苗前后的B细胞库进行高通量测序分析,探讨注射乙肝疫苗后体液免疫的动态过程。方法将志愿者接种乙肝疫苗前后的外周血样进行密度梯度离心获得淋巴细胞并提取RNA,逆转录为cDNA后对B细胞受体H链的CDR3区序列进行高通量测序,以揭示注射乙肝疫苗前后B细胞应答的变化,分析人外周血B细胞受体CDR3的多样性以及序列变化与疫苗应答之间的关系。结果志愿者外周血B细胞受体CDR3的种类和数量在接种疫苗后都有所降低,并表现出其特有的免疫学特征,包括高频取用的V、D、J家族、V-J家族配对发生了改变,CDR3区氨基酸的取用和长度分布也发生显著变化;并且接种疫苗后,志愿者外周血中存在某些寡克隆异常增殖的情况。结论大部分志愿者在接种疫苗后,B细胞受体组库的多样性等发生特征性改变,并且出现某些疫苗接种相关的寡克隆。B细胞受体高通量测序技术可以从克隆水平上监控乙肝疫苗接种后抗体产生和表达的动态变化过程。