体外中脑微环境下骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

目的 应用中脑条件培养基与细胞因子联合诱导骨髓间质干细胞(MSCs)转化为多巴胺能(DA)神经元,探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件.方法 取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养和传代扩增.采用贴壁培养法使MSCs得到纯化.碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导后,依据加入的神经营养因子不同分为对照组及实验组[单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)组、胶质源性神经营养因子(GDNF)组、GDNF+GM1组、GDNF+GM1+中脑条件培养基组].诱导过程中在倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在诱导第3、7天进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸生蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测.计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比.结果 各实验组于诱导第3、7天见不同数量的NSE、TH阳性神经元样细胞,GFAP阴性.对照组及实验各组7 d时NSE阳性细胞数(个/视野,n=10)分别为:对照组2.214±0.779,GM1组22.014±3.624,GDNF组31.345±2.850,GDNF+GM1组40.314±4.203,GDNF+GM1+中脑条件培养基组45.257±5.999.实验各组以GDNF+GM1+中脑条件培养基组NSE阳性细胞率最高,依次为GDNF+GM1组、GDNF组、GM1组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).单独应用GDNF和GM1不能诱导MSCs表达TH,二者联合应用可诱导MSCs表达TH,加入中脑条件培养基可使TH阳性细胞率明显增加,而且随着共培养时间的延长,TH阳性表达增加更显著.结论 中脑条件培养基与细胞因子联合可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,并促进细胞表达TH.     

碱性成纤维细胞生长因子预诱导对骨髓基质干细胞向多巴胺能神经元分化的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导对骨髓基质干细胞（MSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化的影响。方法取雄性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养、传代扩增及纯化。bFGF预诱导24h后,依据加入的神经营养因子不同分为单唾液酸四己糖神经节苷脂（GMl）组、胶质源性神经营养因子（GDNF）组和GDNF＋GMl组,以及对照组。倒置显微镜下观察细胞形态变化,分别在预诱导第3d、7d进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。结果对照组见少量NSE阳性细胞。实验组于诱导第3d、7d见较多数量的NSE、TH阳性细胞,GFAP阴性。bFGF预诱导各组中GDNF＋GMl组NSE、TH阳性细胞率最高,GDNF组次之,GMl组最低,组间比较差异有统计学意义（均P〈0．01）。结论bF—GF预诱导不仅可明显促进GDNF、GMl诱导MSCs向神经元样细胞分化,表达神经元细胞标志物——NSE;还可促进MSCs向DA能神经元分化,表达DA能神经元标志物——TH。     

周围神经细胞悬液对体外培养的骨髓基质干细胞诱导分化的影响

目的应用周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合诱导骨髓基质干细胞(MSCs)转化为多巴胺(DA)能神经元。探索体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件。方法取雄性SD大鼠股骨和胫骨骨髓,进行MSCs的体外培养和传代扩增。碱性成纤维细胞生长因子预诱导后,依据处理因素不同分为对照组及实验组(周围神经细胞悬液组、周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组)。倒置显微镜下观察细胞形态变化,在诱导第7天进行神经元特异烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学检测。计数NSE和TH阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。结果对照组及实验各组7d NSE阳性细胞数分别为2.304±0.767,37.411±2.89.37.836±2.836(细胞数/每视野)。各组以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组NSE阳性细胞率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组及实验各组7d TH阳性细胞数分别为0,10.44±0.511,16.671±0.544(细胞数/每视野)。以周围神经细胞悬液 中脑条件培养基组TH阳性细胞数量较多,差异非常显著(P<0.01)。结论周围神经细胞悬液、中脑条件培养基与细胞因子联合可明显促进MSCs向神经元样细胞分化,并促进细胞表达TH。     

音速波状蛋白促进骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化

目的探讨音速波状蛋白（Shh）促进人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用。方法体外分离、扩增和鉴定人骨髓MSCs。采用不同诱导方案诱导MSCs向神经元和多巴胺能神经元样细胞定向转化后,进行抗神经巢蛋白（Nestin）、神经元特异烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体（DAT）等免疫细胞化学染色,并计算阳性细胞百分率。结果实验组诱导后MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,可见NSE、Nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达;对照组MSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达均为阴性。实验2组（诱导方案含Shh）与1组（诱导方案不含Shh）的NSE、Nestin、GFAP阳性细胞百分率的差异无统计学意义,但实验2组TH和DAT阳性细胞百分率明显高于实验1组,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论Shh可促进MSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。     

抗坏血酸联合胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究

目的 研究抗坏血酸(AA)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响.方法 从新生24h内的sD大鼠脑组织分离和培养神经干细胞,进行神经干细胞鉴定.第二代神经干细胞诱导培养基中分别给予AA或(和)GDNF,10d后终止诱导,进行DA能神经元特异性标记物酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运蛋白的免疫细胞化学检测和TH基因的RT-PCR检测.结果 各诱导组均检测到TH mRNA的表达;与对照组比较,AA及GDNF均能增加NSC向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05);与单独运用100μmol/LAA或10ng/mlGDNF组比较,联合诱导组可明显提高NSCs向TH阳性细胞分化的比率(P<0.05).结论 AA和GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,两者联合诱导后分化作用得到进一步加强.     

胶质细胞源性神经营养因子诱导骨髓基质细胞向多巴胺能神经元分化的观察

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在体外能否诱导骨髓基质细胞（BMSCs）向多巴胺（DA）能神经元分化及可能机制。方法无菌条件下，抽取成年SD大鼠胫骨内骨髓组织，分离制备成单细胞悬液进行培养。将增殖传代至第5代的BMSCs随机分为GDNF诱导组和对照组。继续培养7d后，应用BrdU／GFAP、BrdU/NeuN和TH免疫荧光单标和双标技术检测BMSCs增殖和分化情况。结果两组BMSCs继续培养7d后，增殖仍然活跃，有部分细胞向神经元和胶质样细胞分化，呈Brdu，GFAP、BrdU/NeuN和TH阳性表达，但GDNF组的增殖力更强，向神经元和TH神经元分化的数量明显多于对照组（P〈0．05）。结论GDNF能促进BMSCs的增殖和诱导BMSCs分化成神经元和胶质样细胞，其中少部分可分化为TH神经元（即DA能神经元）。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和定向神经分化

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和定向神经诱导分化的条件.方法 从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有脑源性生长因子(BDNF)联合维A酸(RA)的培养液对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果 诱导1h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,6h后大部分细胞具有典型神经元形态.表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞占细胞总数的(46.45±2.54)%.结论 MSCs可通过体外培养并纯化,应用BDNF联合RA可以在体外诱导MSCs成为神经元样细胞.     

单唾液酸四己糖神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞成为神经前体细胞及其分化作用的研究

目的 探讨单唾液酸四己糖神经节苷脂(GMI)在诱导成年大鼠骨髓基质细胞(MSCs)成为神经前体细胞及其分化中的作用。方法 取成年大鼠骨髓基质细胞,分别以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、GMI和bFGF+GM1作为诱导物诱导,3 d后行纤维连接蛋白(fibronectin)、I型胶原(collagen I)免疫细胞化学及巢蛋白(Nestin)免疫荧光染色,7 d后行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及半乳糖脑苷脂(GalC)免疫细胞化学染色。结果 经bFGF或bFGF+GM1诱导后部分骨髓基质细胞转化为神经前体细胞样细胞,继而分化为神经元和星形胶质细胞样细胞,fibronectin、collagen I染色阳性细胞明显减少,Nestin、NSE和GFAP染色阳性细胞比例明显升高(分别为35.22％±4.27％,22.28％±2.97％和26.65％±3.17％),以bFGF+GMI组更为明显(42.17％±3.65％、30.35％±3.51％和32.22％±2.68％),而单独应用GM1无明显作用。结论 联合应用bFGF与GM1后,GM1可增强bFGF的诱导作用,提高MSCs转化,并促进其向神经元及星形胶质细胞样细胞分化。     

Mes42细胞及细胞因子对中脑和纹状体神经前体细胞的分化作用

了解中脑神经前体细胞和纹状体神经前体细胞在Mes42细胞及细胞因子作用下的体外诱导分化情况.采用含细胞因子或/和Mes42细胞条件培养基和细胞膜碎片的分化培养基培养中脑神经前体细胞和纹状体神经前体细胞,孵育7 d后行免疫细胞化学染色了解其体外诱导分化情况.IL-lα(100pg/ml),IL-11(1 ng/ml),GDNF(1μg/ml)和LIF(1 ng/ml)可诱导中脑神经前体细胞分化成TH阳性神经元,增加分化的TH阳性细胞数目.Mes42细胞条件培养基和其细胞膜裂解碎片以及细胞因子IL-11,LIF,GDNF,IL-1α共同培养神经前体细胞,诱导分化的TH阳性细胞数目无明显增加,但TH阳性细胞的形态更趋成熟.而纹状体神经前体细胞在上述分化培养基内鲜见TH阳性细胞.中脑神经前体细胞可在体外被诱导分化成TH阳性神经元,可能成为帕金森病移植治疗的供体细胞.     

人骨髓间质干细胞的分离培养和诱导分化为神经元样细胞的研究

目的:探索成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化为神经元样细胞的体外条件。方法:采用Ficoll淋巴细胞分离液(1.077g·mL-1)密度梯度离心法从人的骨髓中分离出MSCs进行体外扩增。收集第2代细胞流式细胞仪检测MSCs表面标志。逐渐加入表皮生长因子(EGF)、β-巯基乙醇(BME)和全反式维甲酸(ATRA)诱导MSCs向神经元细胞分化,通过免疫细胞化学法鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶(NSE)、神经巢蛋白(nsetin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果:流式细胞仪检测结果显示培养后的MSCs强表达CD29;较强表达CD44、CD166和CD105;不表达CD45、CD34和HLA-DR。诱导剂诱导后,MSCs分化为具有典型的神经元形态的细胞,免疫细胞化学显示78%的细胞NSE表达阳性;大约51%细胞nsetin表达阳性;所有细胞GFAP均阴性表达。结论:成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞,且具有较高的阳性分化率。     

脐带间充质干细胞的分离培养及诱导分化为多巴胺能样神经元

目的 探索脐带间充质于细胞(MSCs)的分离培养及将其诱导分化为多巴胺能神经元的方法.方法 分离脐带间充质组织,Ⅳ型胶原酶消化分离脐带MSCs,原代培养于含10%FBS的DMEM/F12培养基中,观察细胞形态并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物和细胞周期,CCK8法绘制细胞生长曲线;采用二步法诱导分化P3代脐带MSCs,培养3、6、9 d后终止诱导,应用免疫荧光染色和Wcstern blotting检测分化后细胞酪氨酸羟化酶(TH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达.结果 分离培养的脐带MSCs形态呈相对均一的成纤维样细胞,平行排列或旋涡状生长.P3代细胞CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166表达阳性,而CD34、CD45、CD19、CD31、HLA-DR表达阴性.对数生长期细胞倍增时间为48 h,处于G0～G1期细胞占91.13%;诱导分化后细胞多数为两级,形态与神经元相似,免疫荧光染色检测结果显示诱导9 d时细胞NSE、TH染色阳性率分别为19.5%和8.9%,Weston blotting检测结果显示诱导6 d时细胞NSE表达明显,TH仅有弱表达,诱导9 d时TH、NSE均表达明显.结论 脐带间充质组织中能分离出MSCs,且能分化成多巴胺能神经元.

Abstract：

Objective To investigate the methods of isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) in Wharton' s jelly and the differentiation of MSCs into dopaminergic neurons. Methods The umbilical cord mesenchymal tissue was scraped off from the Wharton's jelly,and then, collagenase Ⅳ was employed to isolate the MSCs. The isolated cells were primarily cultured in DMEM/F12 medium containing 10% FBS. Inverted microscopy was used to observe the cytomorphology, and flow cytometry was employed to detect the cell surface antigens and the cell cycle.We evaluated the cell viability using CCK8 kit. Two-step method was employed to induce the MSCs of the P3 generation to differentiate into dopaminergic neurons, and immunocytochemistry and Western blotting were used to detect the expressions of neuron specific enolase (NSE) and tyrosine hydroxylase (TH) 3, 6 and 9 d after the induction. Results The isolated MSCs showed fibroblast-like shape, with parallel arrangement and vortex-like growth. MSCs of the P3 generation expressed CD73, CD29, CD44and CD105, but did not express CD34, CD45, CD106 and HLA-DR. The doubling time in the exponential phase was at the 48th h of culture, and 91.13% cells were under G0-G1. These cells had similar morphology of the neurons. The immunocytochemical assay showed that the NSE and TH positive rates were 19.5% and 8.9% on the 9th d of induction; and Western blotting showed that MSCs obviously expressed NSE and weakly expressed TH.Conclusion MSCs can be isolated from the umbilical cord mesenchymal tissue, and be induced to differentiate into dopaminergic neurons in vitro.     

神经细胞黏附分子在GDNF保护大鼠多巴胺能神经元中的作用

目的研究神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)在胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)保护帕金森(Parkinson's disease,PD)模型大鼠受损多巴胺(dopamine,DA)能神经元中的作用。方法右侧纹状体内立体定位注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备早期PD模型,而后分为4组:对照组(同侧黑质内注射PBS)、NCAM组(同侧黑质内仅注射anti-NCAM抗体)、GDNF组(同侧黑质内注射GDNF)、NCAM阻断组(同侧黑质内注射anti-NCAM抗体30min后注射GDNF),采用免疫组织化学染色技术和免疫印迹技术,观察各组酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达变化。结果GDNF组黑质致密部TH阳性神经元数目及表达的量明显多于PBS组,差别有统计学意义;NCAM阻断组与GDNF组相比,该处TH阳性神经元数目及表达的量明显减少,差别有统计学意义。结论NCAM参与了GDNF保护DA能神经元的作用。     

稳定表达GDNF／EGFP融合基因的骨髓基质干细胞对多巴胺能神经元的保护作用

目的　 构建GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞 ,并观察其对多巴胺能神经元的营养支持作用。方法　 应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片段 ,以pEGFP C1为载体导入骨髓基质干细胞 (MSCs) ,制备稳定表达GDNF/EGFP融合基因的MSCs工程细胞 ,用联合培养的技术通过倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞与多巴胺能神经元的相互作用。 结果　MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞共培养均能促进多巴胺能神经元的存活和生长 ,MSCs工程细胞作用更强。 结论　 成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞 ,该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用 ,在帕金森病治疗中可能有重要价值     

大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间质干细胞的诱导分化作用

目的 探讨大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法 从大鼠骨髓中分离培养间质干细胞并传至第4代，诱导前24h加10ng／ml碱性成纤维生长因子(bFGF)入培养液中以促分裂，再以正常脊髓、损伤后5d及损伤后40d脊髓匀浆上清液作诱导剂，然后观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法，对诱导后第4d的细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的检测。结果 诱导后第4d的部分细胞不仅在形态上表现为神经元样，而且呈NSE及NF阳性表达，GFAP阴性。结论 脊髓匀浆上清液可以在体外诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

细胞因子联合纹状体条件培养液定向诱导间充质干细胞体外分化为多巴胺能神经元

背景：在众多体外诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化研究中，诱导阳性率仍不理想。 目的：实验应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元，拟探讨提高诱导阳性率的方法。 设计、时间及地点：以细胞为对象的对照观察细胞学实验，于2006-07/2007-12在山东大学齐鲁儿童医院和山东大学第二医院血液实验室完成。 材料：健康成年Wistar大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离，新生Wistar大鼠用于纹状体条件培养液的制备。 方法：采用贴壁法分离纯化健康成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养。取出生24 h内新生Wistar大鼠，完整剥离其大脑组织制备纹状体条件培养液。取体外培养的第5代间充质干细胞，用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的预诱导液进行预诱导，24 h后去除预诱导液，换用纹状体条件培养液进行诱导。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态变化，并应用细胞免疫化学技术检测细胞内神经元特异烯醇化酶和酪氨酸羟化酶表达。 结果：大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和纹状体条件培养液诱导后细胞胞体逐渐回缩成团，形成梭形，部分细胞可见突起伸出，类似神经元。细胞免疫化学检测，诱导后细胞神经元特异烯醇化酶阳性表达率为( 72.70±14.81)%，酪氨酸羟化酶阳性表达率为(34.50±15.93)%。 结论：应用碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子联合纹状体条件培养液诱导分化体系，获得了高比例的神经元，其中包括较多的多巴胺能神经元。     

GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用

目的:克隆GDNF基因并修饰骨髓基质干细胞,观察该工程细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片断,以pECPP-Cl为载体导入骨髓基质干细胞,制备稳定表达GDNF基因的MSCs工程细胞,收集并浓缩MSCs和GDNF’基因修饰的MSCs工程细胞的条件培养液,通过MTT、倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用。结果:MSCs和GDNF基因修饰的MSC工程细胞分泌物均能促进多巴胺能神经元的存活和生长,MSCs工程细胞作用更强。结论:成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞,该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用,在帕金森病治疗中可能有重要价值。