表达腮腺炎病毒和猴免疫缺陷病毒抗原的重组麻疹病毒

麻疹病毒 ( MV )是含非节段性负链RNA基因组的包膜病毒。作者构建了一组重组麻疹病毒 ( r MV) ,分别在基因组中不同部位表达腮腺炎病毒 ( Mu V)的 HN或 F表面糖蛋白或猴免疫缺陷病毒 ( SIV)的 env、gag或 pol蛋白。具体方法为 :采用聚合酶链反应法将编码 Mu V的 HN、F糖蛋白以及 SIV的gag、pol、env蛋白的解读框架扩增后 ,分别克隆进载体 P( + ) MPr GFPV(位于 MV P基因下游 )及 P( + ) MHr GFPV(位于 H基因下游 )中 ,得到了一系列不同的含 Mu V及 SIV蛋白基因的真核表达载体。将它们转染 2 93-3- 46辅助细胞系 ,获得 r …     

腮腺炎病毒及疫苗研究进展

随着对腮腺炎病毒研究的深入,人们对腮腺炎病毒的基因组结构、病毒蛋白的结构和功能有了更多的认识,病毒表面的两种糖蛋白——血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白和融合(F)蛋白是重要的抗原决定簇,HN蛋白抗体可中和病毒感染,而F蛋白是溶血抗原。现今使用的腮腺炎疫苗为减毒活疫苗,对病毒基因序列分析后发现接种疫苗后出现的脑膜炎病例主要与Urabe株有关,目前正在探索发展新一代腮腺炎疫苗。     

一种抗呼吸道合胞病毒和3型副流感病毒的原型重组疫苗

呼吸道合胞病毒(RSV)和3型副流感病毒(PIV-3)在婴幼儿中引起严重的呼吸道感染.目前,这两种病毒的灭活或减毒活疫苗均不能提供有效的临床保护作用,所以迫切需要发展新型疫苗.RSV的融合(F)蛋白和PIV-3的血凝素-神经氨酸酶(HN)分别是这两种病毒中可诱生中和抗体的表面糖蛋白.作者选择这两种蛋白抗原,用基因工程方法,将编码F蛋白前526个氨基酸与HN蛋白第54～573个氨基酸片段串联,应用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中获得了含F_(RSV)-HN_(PIV-3)嵌合蛋白的重组病毒株.     

研制能有效抵抗3型副流感病毒感染的重组痘苗病毒疫苗

改良的痘菌病毒(VV)Ankara株(MVA)是在鸡胚细胞中传500代以上的疫 苗株(其基因组发生多处缺失,不能在哺乳动物细胞中复制,在实验动物中也无致病性).用表达流感病毒血凝素(HA)核蛋白(NP)基因的重组MVA免疫小鼠后,可保护小鼠抵抗致死剂量流感病毒的攻击.作者用表达3型副流感病毒(PIV3)融合(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)糖蛋白基因的重组MVA肌肉或鼻内接种棉鼠,同样达到了抗PIV3呼吸道攻击的效果.用BamHI分别从质粒pTZ18R和PGEM3Zf-切下PIV3的F、HN基因,用Klenow酶和脱氧核苷三磷酸切去F基因末端,克隆于含有2个VV早期/晚期启动子的质粒pJS-5中的SnaBI位点.将HN基因也插入其Bam HI位点,成为带HN和F基因的质粒pLW-1.含双启动子盒的HN和F基因转移入质粒GO6,GO6含有MVA侧翼序列,可插入MVA delⅢ中,形成的质粒叫pLW-2.     

由转染的哺乳动物细胞系产生的2型登革病毒胞外亚病毒颗粒及对其作为亚单位疫苗的研究

本试验旨在建立一个能持续稳定地表达2型登革病毒胞外亚病毒颗粒 ( EP)的细胞系 ,并评估 EP在小鼠中的免疫原性。 EP是无核壳 ,但有前膜 ( pr M)、包膜 ( E)埋置于双脂层中的病毒颗粒。为此 ,作者首先构建了重组质粒 pc D2 EP,它编码 2型登革病毒新几内亚 C( NGC)株的 E蛋白和在 pr M/M裂解位点处有突变的 pr M蛋白 ,后者可抑制 E蛋白的融合活性 ,减少表达病毒蛋白对细胞的毒性作用。pr M/E的共表达有利于细胞稳定生产 EP。质粒 pc D2 EP转染 CHO- K1细胞后 ,经过四轮有限稀释克隆法筛选出了能高水平表达蛋白的转染细胞—— D…     

VEGF-C siR NA抑制人结肠腺癌细胞株VEGF-C表达

目的 构建Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP腺病毒载体,观察腺病毒介导的VEGF-CsiRNA对人结肠腺癌LOVO细胞血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的影响.方法 设计并合成VEGF-C mRNA siRNA,构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6.转染人结肠腺癌LOVO细胞.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测其对VEGF-C表达的抑制效果.结果 成功构建重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,纯化后获得7.9×10<'9>IU/ml滴度的病毒.转染LOVO细胞48 h后,VEGF-C mRNA表达下降为对照组的(30.7±1.2)%(P<0.05);VEGF-C蛋白的表达也明显受到抑制,转染72 h后下降为对照组的(47.8±2.2)%(P<0.05).结论 腺病毒介导的VEGF-C RNA干扰可显著抑制人结肠腺癌细胞的VEGF-C表达.     

大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及在肾系膜细胞中的表达

目的 利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体,转染大鼠肾小球系膜细胞(GMC),并通过Western Blot法检测GR蛋白的表达.方法 将质粒pcDNA1 Neo-Rat GR扩增、凝胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR,经人胚肾293A细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR;用包装后的病毒上清转染大鼠GMC,提取细胞中总蛋白,通过Western Blot方法 检测GR蛋白的表达.结果 连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒,经人胚肾293细胞包装,48 h后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得1×109 PFU /ml 滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-Rat GR,转染大鼠GMC 48 h后提取细胞总蛋白,Western Blot检测GR蛋白有明显表达.结论 构建的大鼠GR基因腺病毒载体能够在大鼠GMC 中表达GR蛋白,并有上调作用.     

反义阻断hMMS2基因表达以抑制细胞生长

将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因h MMS2的 c DNA特定反向克隆到本室改建的真核细胞表达载体 p MAMneo- amp-中 ,构建了表达h MMS2反义 RNA的重组质粒 .将此反义表达重组质粒 (p MAM- anti- h MMS2 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜 FL细胞 ,建立 FL- h MMS2 -细胞系 .比较该细胞系及 FL细胞和转染了空载体 p MAMneo-amp-的 FL细胞 (FL- MAMneo细胞 )的生长速度 ,发现 FL- h MMS2 -细胞系在地塞米松诱导下h MMS2基因表达被反义抑制后导致细胞生长受阻 ,提示 h MMS2基因为细胞生长所必需 .     

杆状病毒作载体表达人呼吸道合胞病毒F糖蛋白免疫棉鼠研究

呼吸道合胞病毒(RSV)是周岁龄以下儿童严重下呼吸道疾病的主要病因,但迄今尚无令人满意的疫苗可供使用。作者利用基因重组技术表达了RSV的F糖蛋白,并对其作为亚单位疫苗的可能性进行了研究。首先把RSVF糖蛋白基因克隆到pUC19质粒,随后经不同酶切、聚合、连接得到两个不同COOH端长度的F蛋白基因克隆,再整合到杆状病毒载体pAc373中,并使之处于多角体启动子控制之下,组建了Ft_6 Ba-7和Ft_2Ba-两重组基因作为表达不同COOH端F蛋白。把F蛋白基因转移到AcNPV基因     

线性化聚乙烯亚胺介导的高效瞬时转染条件的优化

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear, PEI)介导的高效瞬时转染条件, 提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率。方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)/pcDNA3.1+, 通过瞬时转染的方式将质粒转入HEK293F细胞中进行表达。对转染试剂PEI与重组质粒的比例以及收获时间进行优化, 通过倒置显微镜观察、SDS-PAGE和流式细胞仪检测目标蛋白的表达量, 确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件。采用优化后的条件在T500摇瓶(工作体积120 ml)中进行扩大表达。结果构建的重组质粒EGFP/pcDNA3.1+序列正确, 在重组质粒浓度为3.0 μg/ml、DNA∶PEI为2∶1、转染后24 h添加终浓度为2 mmol/L的丙戊酸钠、转染后4 d收获条件下, 目的蛋白的表达量最高。此条件也适用于放大培养体积至T500的瞬时转染。结论优化了一种快速有效的基于PEI的瞬时转染方法来高水...     

构建含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的实验研究

目的 构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)重组逆转录病毒载体.方法 将Hyg和EGFP基因片段分别插入逆病毒载体质粒pCMV-LL-SA-2中,构建重组的逆病毒质粒pCMV-EGFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞产生重组逆病毒,感染白血病细胞株K562.结果 成功构建重组逆病毒载体质粒pCMV-EGFP-hyg,与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24 h和48 h,细胞培养上清中的病毒滴度分别为7.5×105CFU/ml和1.5×106 CFU/ml.K562细胞经与产毒293T细胞协同培养感染重组逆病毒后,表达EGFP的阳性细胞比率为59.6%.经Hyg筛选后,98%以上的K562细胞为EGFP表达细胞.结论 成功构建了含EGFP和Hyg的重组逆转录病毒载体,可以产生较高滴度的目的 病毒;并且建立了稳定持久表达EGFP的K562白血病细胞系.     

携带狂犬病病毒糖蛋白基因的质粒载体能诱导保护性免疫力

作者构建了在SV40早期启动子控制下表达狂犬病病毒糖蛋白的质粒载体pSG5rab.gp.对C3H/He小鼠于左腓肠肌作肌肉注射,用~(51)Cr释放试验测定糖蛋白特异性细胞毒性T(TC)细胞应答.结果表明,150μg质粒免疫1次,不能诱导特异性Tc细胞应答.免疫两次,间隔2～3周,可诱导抗狂犬病病毒G蛋白中抗原决定簇的Tc细胞应     

信号转导和转录激活因子基因表达的抑制及其对HepG_2细胞增殖的影响

目的探讨应用RNAi技术沉默信号转导和转录激活因子(STAT3)基因对肝癌HepG2细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(SiRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人肝癌细胞HepG2细胞。通过半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染后细胞增殖的变化。结果成功构建了pGeneSil 1-shRNA-STAT3重组质粒,并转染HepG2肝癌细胞;半定量RT-PCR、Western blot结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在mRNA及蛋白水平上显著低于对照组;MTT实验结果显示,重组质粒转染组细胞的增殖明显受到抑制。结论pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2肝癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制肝癌细胞的生长及增殖。     

重组adv5.oriP.HRP腺病毒载体构建及对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达

目的:构建腺病毒载体adv5.oriP.HRP,观察其对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达。方法:采用p△EIsp1A穿梭质粒系统,酶切、定向克隆方法构建含HRP自杀基因的p△EIsp1A/oriP-HRP重组质粒,在293细胞中进行重组腺病毒adv5.oriP.HRP包装、扩增、纯化与病毒滴度测定,体外转染EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株与EBV阴性鼻咽癌CNE-2Z细胞株,RT-PCR法检测不同细胞系中adv5.oriP.HRP的表达,Western blot法检测经不同浓度adv5.oriP.HRP转染后细胞中HRP蛋白的表达。结果:p△EIsp1A/oriP-HRP在293细胞中包装扩增后的病毒滴度为528@1012TCID50/L;体外转染鼻咽癌C666-1细胞株与CNE-2Z细胞株后,RT-PCR检测到C666-1细胞系1229bp处得明亮条带,而CNE-2Z细胞几乎未检测到重组基因mRNA的表达,Western blot可见随着MOI的增加C666-1细胞中HRP蛋白表达逐渐增多,而在CNE-2细胞中HRP蛋白的表达几乎呈阴性,两组间差别有统计学意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒adv5.oriP.HRP能在EBV阳性的鼻咽癌C666-1细胞株内靶向性转染和表达。     

PI16重组腺病毒表达载体的构建及其在人主动脉瓣间质细胞中的表达

目的构建携带人肽酶抑制蛋白16(PI16)基因的重组腺病毒表达载体,并研究其在人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)中的表达。方法合成带有EcoRⅠ酶切位点的PI16引物,PCR扩增PI16基因,将目的基因克隆到穿梭载体pAV-MCMV-GFP-3FLAG中,PCR及测序鉴定穿梭质粒pAV-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。将穿梭质粒与辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK 293细胞,获取重组腺病毒Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG。转染HEK 293细胞大量扩增后,采用CsCl梯度离心法纯化病毒,半数组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。用Ad-MCMV-PI16-GFP-3FLAG感染hAVICs,Western blot检测PI16在hAVICs中的表达。结果成功构建了表达PI16蛋白的重组腺病毒,滴度达到5.01×1010 TCID50/ml,转染hAVICs后能高效地表达PI16蛋白。结论成功构建携带人PI16基因的重组腺病毒,为进一步研究PI16基因的作用提供了基础。     

短发夹RNA对前列腺癌细胞中PIM-1基因沉默效应的研究

目的:探讨脂质体介导的短发夹RNA(shRNA)对前列腺癌细胞中PIM-1基因表达的影响.方法:构建3种针对PIM-1 mRNA不同靶点的shRNA重组质粒表达载体,并转染前列腺癌PC-3细胞.分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中PIM-1 mRNA及蛋白的表达情况.结果:转染48 h后,3种PIM-1基因靶向性shRNA表达质粒均可抑制PC-3细胞中PIM-1 mRNA和蛋白的表达,其中靶向PIM-1 mRNA第707-725位和1080-1098位序列的重组质粒干扰效果更显著.结论:本研究所构建的PIM-1 shRNA表达质粒可在体外高效特异地抑制前列腺癌细胞中PIM-1的表达,为下一步研究奠定了基础.     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

重组体表达的病毒样颗粒准型可作为疫苗研制的新途径

作者用表达逆转录病毒gag蛋白与单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白的痘苗病毒重组体共感染细胞,可产生病毒样颗粒准型(pseudotype)。这种准型颗粒是以非感染性的颗粒状态模拟天然抗原提呈过程来提呈病毒糖蛋白抗原的一种新方法。 先将猿猴免疫缺陷症病毒(SIVmac251)gag-pol区的全部4800个碱基对(bp)插入质粒pAbT4587得pAbT4660,将含2型HSV糖蛋白gD基因完整序列的1400个bp插入     

干扰素诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶体外抗乙型肝炎病毒活性的研究

目的构建表达双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)融合绿色增强荧光蛋白(p EGFP-PKR)真核表达质粒,并进一步研究PKR蛋白在体外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。方法以p EGFP-N1为空载体,运用分子克隆技术构建重组质粒p EGFP-PKR,通过双酶切和直接测序两种方法验证重组质粒p EGFP-PKR是否构建成功。以能分泌完整HBV病毒颗粒子的肝胚瘤细胞株Hep G2.2.15细胞为细胞模型,采用重组质粒转染方式处理Hep G2.2.15细胞,运用荧光显微镜观察融合蛋白p EGFP-PKR在细胞内的表达,以电化学发光方法和实时荧光定量PCR技术分析细胞上清HBV抗原表达和细胞病毒复制水平。结果酶切鉴定和序列分析证实成功构建重组质粒p EGFP-PKR,转染Hep G2.2.15细胞后在荧光显微镜下可见融合蛋白p EGFP-PKR表达,同时细胞分泌的HBV抗原与空载体组相比较明显下降(P<0.05),而细胞外HBV复制水平未见明显变化。结论在体外肝细胞模型中,PKR蛋白具有一定的抗HBV活性作用。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。