两种方法分离人抗肾小球基底膜抗体靶抗原

目的：比较超声粉碎法和化学去污剂法对人抗肾小球基底膜(GBM)抗体靶抗原(粗抗原)的分离纯化效果。方法：取正常肾组织分离肾小球，用两种方法分别分离GBM，将胶原酶消化后的可溶性蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用Western blot和EHSA法检测抗GBM抗体与所分离靶抗原的反应情况。结果：电泳结果显示两种方法分离纯化的可溶性蛋白相对分子质量都主要位于27ku和54ku，且均为抗GBM抗体阳性血清所识别。ELISA显示两种方法分离纯化的蛋白与抗GBM抗体相关疾病患者的血清均呈阳性反应。结论：两种方法都可以用于抗GBM抗体靶抗原的分离纯化，且化学去污剂方法更为简便。     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞,同时采用免疫荧光技术,利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体:抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性,而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性,说明培养的细胞为系膜细胞。结论该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的 分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法 筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞，同时采用免疫荧光技术，利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体；抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果 抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性，而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性，说明培养的细胞为系膜细胞。结论 该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

MRL／lpr小鼠肾组织MCP-1表达及MMF对其表达的影响和相关机制研究

目的：检测MRL／lpr狼疮小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达及探讨霉酚酸酯（MMF）对其影响和相关机制,研究MMF对MRL／lpr狼疮小鼠的治疗作用。方法：MRI/lpr狼疮小鼠分为对照组和治疗组两组。观察肾组织病理学改变及其MCP-1、CD14和蛋白激酶C（PKC）等的表达以及尿蛋白、抗ds—DNA抗体水平的变化。结果：对照组小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织MCP-1表达上调,CD14^＋细胞数明显增多,伴尿蛋白及抗ds—DNA抗体水平增加。治疗组小鼠肾组织MCP—l表达减少,CD14^＋细胞数减少,尿蛋白和抗ds—DNA抗体水平减少,且肾小球MCP-1与其PKC表达水平及肾小球CD14^＋细胞数、尿蛋白水平呈直线相关关系。结论：MMF对MRL／lpr小鼠自发狼疮肾炎具有治疗作用,其机制可能通过抑制PKC通道激活减少小鼠肾组织MCP-1的表达,从而减少肾组织单核细胞的浸润,减轻肾脏损害。     

慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠模型的诱导

目的　诱导慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠模型。方法　选用 (DBA 2×C57BL 6J)F1小鼠 ,通过尾静脉注射其母鼠DBA 2淋巴细胞诱导模型 ,观察 12周。结果　F1小鼠注射母鼠淋巴细胞后 2周产生自身抗体 ,出现蛋白尿 ,4周血脂、血肌酐、尿素氮轻度升高 ,肾脏病理仅有系膜细胞轻度增生 ,未见间质损害。 8周血生化指标明显改变 ,肾脏病理示肾小球系膜细胞中度增生 ,间质炎细胞浸润和肾小管大量蛋白管型 ,10～ 12周各项观察指标改变明显 ,病理出现局灶或弥漫肾小球硬化 ,免疫荧光示IgG、IgM、C3沿毛细血管壁及系膜区沉积。结论　慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠模型类似人类狼疮性肾炎 ,是良好的狼疮肾炎模型     

抗内皮细胞抗体在狼疮性肾炎临床和病理改变中的意义

目的 探讨抗内皮细胞抗体在狼疮性肾炎临床和病理改变中的意义。方法 采用细胞酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）,对５８例狼疮性肾炎病人血清进行抗内皮细胞抗体检测,并以提取的内皮细胞蛋白为抗原,应用免疫印迹方法对抗内皮细胞抗体的抗原进行了分析。     

牛肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1的分离纯化及其在抗肾小球基底膜相关疾病中的应用

目的:分离纯化抗肾小球基底膜(GBM)抗体的特异性靶抗原,并评价其在抗GBM抗体检测中的应用价值.方法:通过孔径不同的筛网从牛肾脏中提取牛肾小球,采用改良的40 g*L-1去氧胆酸钠破坏肾小球细胞而获得GBM,经胶原酶消化后收集可溶性牛GBM粗抗原.在pH 7.5的条件下经Mono Q阴离子交换层析柱分离纯化肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1[α(Ⅳ)NC1],并经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot鉴定其纯度及活性.应用2 mg*L-1纯化的牛α(Ⅳ)NC1包被酶标板,建立牛α(Ⅳ)NC1-ELISA 方法检测血清中抗GBM抗体,并与经典的以人GBM可溶性蛋白为粗抗原的ELISA法进行对照研究.血清来自90例已知抗人GBM抗体阳性的患者、100例正常人和50例其他肾脏疾病患者.对两种方法进行相关分析并计算牛α(Ⅳ)NC1-ELISA的敏感性、特异性.结果:纯化的牛α(Ⅳ)NC1经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为相对分子质量为25×103和50×103的蛋白并可被抗GBM抗体阳性血清所识别;应用牛α(Ⅳ)NC1-ELISA法检测抗GBM抗体的敏感性和特异性分别为100%和98%,与人GBM粗抗原-ELISA的相关性为0.6.结论:应用改良的去氧胆酸钠方法破坏肾小球内细胞并进一步经MonoQ离子交换柱分离纯化牛α(Ⅳ)NC1,可以得到高纯度的特异性靶抗原;纯化的牛α(Ⅳ)NC1可以作为特异性抗原来检测人抗GBM抗体.     

白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂和抗白细胞介素6抗体对NZB/WF_1小鼠狼疮性肾炎的影响

观察白细胞介素Ⅰ受体拮抗剂（IL-1ra）和抗白细胞介素6抗体（抗IL-6）对9月龄狼疮倾向NZB／WF1小鼠肾脏的形态学表现：IL-1ra组为轻度局灶性系膜增生性肾小球肾炎，病变单一；抗IL-6组呈中度弥漫性系膜增生性肾小球肾炎；盐水对照组为重度弥漫性系膜增生性肾小球肾炎伴明显病变多样性改变。电镜下3组肾小球内均可见多处电子致密物沉积，但IL-1ra组小且少，盐水组则大且多。结果提示，IL-1ra有明显减轻狼疮倾向NZB／WF1小鼠肾小球病理损害作用，从而延缓肾小球硬化，改善肾功能。抗IL-6组亦对小鼠肾小球病变有改善作用。     

旋毛虫膜蛋白新基因Tmp10的免疫筛选及鉴定

目的免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,寻找抗旋毛虫病的疫苗候选抗原或诊断抗原。方法应用旋毛虫感染的猪血清免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库,获得阳性克隆。将一阳性克隆与原核表达载体p ET-28a(+)构建重组质粒,异丙醇硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导后,利用亲和层析柱纯化目的蛋白,并通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blotting鉴定其抗原特异性和免疫原性。结果免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得42个阳性克隆,选取一个新基因Tmp10,成功构建了重组质粒p ET-28a(+)/Tmp10,诱导表达后获得的重组蛋白(r Tmp10)的相对分子质量约为40 000。Western blotting检测结果显示,该重组蛋白可被旋毛虫感染小鼠和猪血清所识别,具有抗原特异性。r Tmp10免疫小鼠可诱导产生高滴度的抗体,显示其具有较好的免疫原性。结论免疫筛选旋毛虫成虫c DNA文库获得一个新基因Tmp10,生物信息学分析预测其为膜蛋白,其重组蛋白(r Tmp10)具有较好的抗原特异性和免疫原性。     

抗小鼠PGRP-L单表位多克隆抗体的制备

目的 制备抗小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)单表位多克隆抗体.方法 应用生物信息学技术预测小鼠mPGRP-L分子的B细胞优势表位,人工合成抗原肽,采用MBS法将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫家兔获取mPGRP-L抗血清,采用HiTrap proteinG柱和抗原肽亲和层析柱纯化抗体,以ELISA和Western blotting进行鉴定.结果 确定了位于mPGRP-L分子N端第85～104位残基的1个B细胞优势表位NH2-(C)DPHSLSPELQALISEVAQHDCOOH,合成短肽并制备KLH-肽偶联物,免疫家兔得到的抗血清效价达1:256 000.分别以HiTrap protein G柱和抗原肽柱亲和层析纯化获得兔抗mPGRP-L单表位多克隆抗体mPGRP-Lnl和mPGRP-Ln2.纯化抗体能与重组蛋白pET-mPGRP-Ln结合,经Western blotting分析,在相对分子质量约29 000处可见清晰的反应条带.结论 获得抗mPGRP-L单表位多克隆抗体,为mPGRP-L分子的研究提供了工具.     

肾小管间质性肾炎中抗肾小管基底膜抗体的检测

目的:探讨肾小管间质性肾炎(tubulointerstitial nephritis,TIN)患者血清中抗肾小管基底膜抗体及其意义.方法:选取北京大学第一医院肾内科2000年至2002年经肾穿刺活检确诊为TIN患者46例.抗肾小管基底膜抗体检测用Westem-blot方法.人肾小管来源于肾肿瘤切除肾脏的正常肾皮质,并经不同目数的筛网获得.肾小管基底膜(tubular basement membrane,TBM)经超声粉碎细胞后得到,在经6 mol/L盐酸胍处理后即为TBM可溶性抗原.分别对阳性和阴性患者的临床指标进行统计分析.结果:其中11人检出抗TBM抗体,可识别34×103、55×103、61×103、72×103、85×103、94×103、119×103蛋白条带,其中识别55×103的患者最多,占63.6%.抗TBM抗体阳性率在急性TIN患者中为29.6%,慢性TIN患者中为21.1%,两者相比差异无显著性.急性TIN患者抗TBM抗体阳性者与阴性者相比,其血沉和血清IgG、IgM均较高,差异有显著性.其它指标包括性别、年龄、血红蛋白、补体C3、IgA、血肌酐及内生肌酐清除率等差异均无显著性.慢性TIN患者上述指标差异均无显著性.结论:部分TIN患者血清中可检测到抗TBM抗体,提示自身免疫因素有可能参与了间质性肾炎的发病机制.     

The significance of anti-endothelial cell antibodies in patients with lupus nephritis and immunoblotting analysis of the target components

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆａｎｔｉｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｌｕｐｕｓｎｅｐｈｒｉｔｉｓＭｅｔｈｏｄｓ...     

Identification of Target Antigens of Asexual Blood Stages of Plasmodium falciparum

Seven monoclonal antibodies (McAbs) specific for Plasmodium falciparum (Pf), humanimmune sera of three individuals, two adults and one child, living in a malaria endemic area inHainan Island of China and immune sera of BALB/c mice immunized with the erythrocytic stages ofPF were used to identify the target antigens of asexual blood stages of Pf. The ~(125)I-labeled surfaceantigens with apparent molecular weights of 125, 115, 83, 74 and 67 KDa were mainly recognizedby McAbs 93A3, 94B5, 92D4 and 93D4, but the ~(125)I-labeled surface antigens of 200 and 19 KDawere recognized by McAb 94Dl alone. In addition, the ~(35)S-methionine- labeled target antigens of183, 125, 83 and 55 KDa were also recognized by McAbs 93A3, 94B5 and 94C3. The McAb21E3 against the culture supernatant antigen of Pf only recognized the antigen of 125 KDa labeledwith ~(15)S-methionine. The human immune sera from the adulst living in a malaria endemic area andmouse immune sera not only immunoprecipitated the target antigens which were recognized by theMcAbs but also immunoprecipitated the polypeptides of 140, 100 and some lower - molecularweight. But these target antigens recognized by McAbs, adult immune sera of and mouse immunesera could not be immunoprecipitated by human immune serum of the child with a primary infec-tion. With the antigen competition assay, the unlabeled antigens of Pf could strongly inhibit the im-mune reaction between the McAbs and the ~(125)I-labeled antigens of Pf. It suggested that the antigensrecognized by McAbs and polyvalent immune sera were specific target antigens.     

不同培养条件对旋毛虫肌幼虫产生排泄分泌抗原的影响

目的对比在常规1640培养基中和在模拟宿主生理环境的培养液的刺激下旋毛虫肌幼虫排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原产量及成分的变化,同时观察在感染初期ES抗原的不同组分在小鼠体内诱导产生主要抗体的时间,以寻找获得更高产量的肌幼虫ES抗原的制备方法。方法在虫数、培养液体积、培养时间、温度、ES抗原体积浓缩倍数等条件相同的情况下,按培养液中小鼠血清超滤液(简称血超)、还原型谷胱甘肽(简称谷胱甘肽)和胆汁粉的不同组合分组,分别培养肌幼虫并收集ES抗原,再以相同上样体积作SDS-PAGE电泳,Odyssey双色红外激光成像系统扫描凝胶并测定条带信号强度进行定量比较。用Western blotting对比观察不同组ES抗原的活性及成分变化。以旋毛虫人工感染小鼠不同时期收集的血清(感染后15、18、20、21、22、24、27、30、40、50 d)作为一抗进行Western blotting,观察ES抗原主要成分在小鼠体内产生抗体的先后顺序。结果S DS-PAGE电泳凝胶定量分析结果显示,血超+谷胱甘肽组、胆汁组和胆汁+血超组的抗原产量明显高于1640培养基组,其中胆汁+血超组的抗原产量最高。Western blotting结果显示,各组抗原均能被感染血清(感染后40 d)识别产生多个条带,其中血超+谷胱甘肽组的条带中相对分子质量约为87 000的条带荧光信号明显强于其他组;感染初期ES抗原不同组分在小鼠体内产生抗体的先后顺序为:45 000、53 000、41 000,其抗体可被检测到的最早时间分别为感染后15、21、24 d。结论培养液中添加胆汁粉可大大提高旋毛虫肌幼虫ES抗原产量,胆汁粉与血超共用后ES抗原的增产效果更佳;感染初期肌幼虫ES抗原的不同组分诱导小鼠产生抗体的时间不同。此研究将为改进ES抗原制备方法,寻找旋毛虫病早期诊断抗原提供实验依据。     

抗中性粒细胞胞浆抗体在肾炎综合征中的检测及临床意义

目的 探讨抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）及其靶抗原检测在肾炎综合征中的临床意义。方法 应用间接免疫荧光（IIF）检测100例肾炎综合征患者血清抗中性粒细胞胞浆抗体,对其阳性的29例用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测靶抗原髓过氧化物酶（MPO）和蛋白酶3（PR3）。结果 ⅡF检测肾炎综合征ANCA阳性率为29％,其中胞浆型10％、核周型19％。急性型肾炎、狼疮性肾炎、紫癜性肾炎阳性率分别为56％、20％和15％。ELISA检测在急进性肾炎和紫癜性肾炎大多数识别靶抗原MPO,狼疮性肾炎ANCA不识别MPO或PR3。结论 ANCA在急性性肾炎和狼疮性肾炎中阳性率高,有重要诊断意义,对狼疮性肾炎活动及疗效判断也具有参考价值。     

Anti-ribosomal P antibodies are associated with nephritis, vascular thrombosis and lymphocytopenia in patients with systemic lupus erythematosus

In the present study, anti-ribosomal P antibody in sera of patients with systemic lupus erythematosus was assayed using an enzyme-linked immunosorbent assay, and its association with clinical symptoms of the patients was analyzed. The presence of anti-ribosomal P antibody was associated with increased frequency of lupus nephritis in the presence of anti-DNA antibody, and was associated with increased frequency of vascular thrombosis in the presence of anti-beta2 glycoprotein I antibody and/or lupus anticoagulant. The level of anti-ribosomal P antibody correlated inversely with the peripheral lymphocyte counts.     

幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究

目的获得重组幽门螺杆菌（H．pylori）脂蛋白（rLpp20）,并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P．2／Lpp20在大肠杆菌（E．coli）BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western．blot检测纯化产物（rLpp20）的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20（43000Mr）,纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91．0％,特异度为100％。与试剂盒法比较,两者的符合率为95．5％。结论Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。     

紫外线照射日本血吸虫尾蚴疫苗保护性抗原的筛选

目的：分析经紫外线照射处理后日本血吸虫尾蚴蛋白的差异性表达，并从中筛选出有效的保护性抗原组分。方法：收集尾蚴，制备抗原，进行SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，与照射尾蚴免疫血清和正常感染血清分别进行免疫印渍(Western blot)试验，比较两反应条带的差异性，筛选出惟有免疫血清所能识别的特有的抗原组分，并测定其分子量。结果：在童虫抗原中发现一条能被免疫血清所识别的特异性抗原条带，并测得其分子量为75kDa。结论：紫外线照射致弱尾蚴可诱导宿主产生特异性抗体，被该抗体所识别的抗原分子量为75kDa。