CD_3AK细胞体内、外抗喉鳞癌细胞株(Hep-2)的实验研究

为探索更理想的过继免疫治疗手段,对由健康人外周血分离、经 CD_3单克隆抗体与白细胞介素-2共同诱导激活的 CD_3AK 细胞的体外扩增情况及其杀伤喉癌细胞 Hep-2的活性水平进行了观察和研究,并与 LAK 细胞作了比较。研究发现,CD_3AK 细胞除具有体外扩增能力强、存活时间长、IL-2依赖性低等特点外,其体内、外抗喉癌作用亦十分显著。培养早期,CD_3AK 细胞的抗瘤活性与常规培养的 LAK 细胞相似,延长培养时间至7～10天,则抗瘤活性大增,培养9天的CD_3AK 细胞在效靶比30:1的条件下平均抑瘤率高达99.8%,几乎完全抑制了喉癌细胞在裸鼠皮下的生长。研究提示,CD_3AK 细胞有望成为继 LAK 细胞之后的新一代肿瘤免疫杀伤细胞而应用于头颈肿瘤局部过继免疫治疗中。     

重组毒素MSH-Ang对喉癌Hep-2细胞的毒性作用研究

目的：研究重组毒素MSHAng对喉癌Hep-2细胞的毒性。方法：应用纯化的MSH-Ang进行体外细胞毒性实验,观察对喉癌细胞的生长抑制作用。结果：重组蛋白对喉癌细胞的生长有明显抑制作用,随着浓度梯度的增加,其抑制作用明显增强,细胞的死亡率逐渐增大。结论：重组毒素MSH-Ang不仅对已知的高表达MSHR的肿瘤具有特异性杀伤作用,还是一种对多种常见肿瘤细胞具有杀伤功能的导向毒素。     

槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用

目的:探讨槲皮素对体外培养的人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2生长的影响及作用机制,研究槲皮素治疗喉癌的可行性.方法:采用MTT法、倒置相差显微镜及流式细胞仪观察槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用情况.结果:槲皮素呈时间和浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,使Hep-2细胞贴壁能力减弱,形态变小变圆,悬浮细胞和颗粒增加,引起Hep-2凋亡,细胞周期阻滞于S期.结论:槲皮索能够抑制喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的生长和增殖,其抑制作用与细胞凋亡有关.     

平阳霉素对体喉鳞癌细胞超微结构的影响

目的：探讨应用平阳霉素短程化疗对在体喉鳞癌细胞超微结构的影响。以论证临床应用该方法的科学性和合理性，方法：随机选择6例经病理确诊的喉鳞状细胞癌患者，化疗前后分别取活组织透射电镜观察。结果：化疗后肿瘤细胞的超微结构出现明显变化。表现为细胞及核膜变形，核仁碎裂，崩解、固缩或消失，细胞质内线粒体明显减少，嵴结构模糊不清，出现空泡变性，核内染色质变性呈不均匀粗块状，但桥粒结构和张力原纤维无明显变化，结论：平阳霉素能使喉鳞癌细胞的超微结构产生明显改变，从而可有效地抑制肿瘤细胞增殖，术前应用平阳霉素可杀灭微小病灶，提高手术切除率。     

CD3A细胞体内,外抗喉鳞癌细胞株（Hep—2）的实验研究

为探索理理想的过继免疫治疗手段，对由健康人外周血分离、经ＣＤ３单克隆抗体与白细胞介素－２共同诱导激活的ＣＤ３Ａ细胞的体外扩增情况及其杀２务喉癌细胞Ｈｅｐ－２的活性水平进行了观察和研究，并与ＬＡＫ细胞作了比较。研究发现，ＣＤ３ＡＫ细胞除具有体外扩增能力强，存活时间长、ＩＬ－２依赖性等特点外，其体内、外抗喉癌作用亦十分显著。培养早期，ＣＤ３ＡＫ细胞的抗瘤活性与常规培养的ＬＡＫ细胞相似，延长培养时间至７     

平阳霉素对在体喉鳞癌细胞超微结构的影响

目的探讨应用平阳霉素短程化疗对在体喉鳞癌细胞超微结构的影响,以论证临床应用该方法的科学性和合理性.方法随机选择6例经病理确诊的喉鳞状细胞癌患者,化疗前后分别取活组织行透射电镜观察.结果化疗后肿瘤细胞的超微结构出现明显变化.表现为细胞核及核膜变形,核仁碎裂、崩解、固缩或消失,细胞质内线粒体明显减少,嵴结构模糊不清,出现空泡变性,核内染色质变性呈不均匀粗块状,但桥粒结构和张力原纤维无明显变化.结论平阳霉素能使喉鳞癌细胞的超微结构产生明显改变,从而可有效地抑制肿瘤细胞增殖,术前应用平阳霉素可杀灭微小病灶,提高手术切除率.     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

可溶性喉鳞癌抗原诱导TAK细胞的免疫学特征

从喉鳞癌患者的手术切除标本中提取的可溶性抗原具有免疫活性，在抗CD3单抗和rIL－2的协同作用下，能刺激外周血单核细胞（PBMC）增殖产生CD8＋细胞毒T淋巴细胞为主的杀瘤细胞，称其为TAK细胞。它是异质性细胞群，其细胞表型以CD8＋细胞为主，具有活化的淋巴母细胞的形态学特征，常形成集落，并表达活化的淋巴细胞的表面标记，如IL－2受体。     

巨噬细胞集落刺激因子对喉鳞状细胞癌喉癌细胞株的作用

目的:了解和探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)及其受体对喉鳞状细胞癌细胞株(Hep2)细胞系的作用。方法:使用氚标记胸腺嘧啶核苷(3HTDR)掺入法和MTT法测试MCSF作用于Hep2后细胞的增殖状况,并测试加入巨噬细胞集落刺激因子受体(MC-SFR)抗体后细胞生长情况。ELISA法测试M-CSF作用Hep2细胞后上清中的MCSF的浓度变化。结果:Hep2细胞培养后较培养前的上清中的MCSF的浓度升高。加入的M-CSF浓度越大,细胞增殖越差,加入MCSFR抗体浓度越大细胞增殖越好。结论:MCSF对喉癌细胞Hep2细胞的增殖具有抑制作用。     

LAK细胞体外及裸鼠体内抗喉癌Hep-2细胞作用的研究

采用乳酸脱氢酶法测定不同浓度rIL-2诱导的LAK细胞在体外抗喉癌Hep-2细胞的杀瘤活性,证实rIL-2对LAK细胞抗喉癌Hep-2细胞杀伤力的激活呈剂量依赖性,1×10~6U/L rIL-2为诱导LAK细胞抗喉癌活性的最适浓度;在该条件下诱导的LAK细胞于培养的第4～7天抗喉癌活性达到高峰,约为40％～50％,至培养第11天仍可保持30％的杀瘤率。裸鼠体内实验也证实,培养4天和9天的LAK细胞在裸鼠体内抑瘤率分别为65％和70％。可见,LAK细胞对喉癌Hep-2细胞具有较强烈且持久的杀伤力。本研究可为临床开展喉癌的局部过继免疫治疗提供实验室依据。     

重组腺病毒介导的p16基因在喉癌细胞系Hep-2的表达

目的 研究外源性P16基因对喉癌细胞系Hep-2的作用，并探讨P16基因用于治疗喉癌的可行性，方法 将重组体泉病毒介导的P16基因转染到人喉癌细胞系Hep-2，用免疫组化、打点杂交方法检测P16基因在细胞转染前后的表达情况，应用流式细胞仪，细胞DNALadder等方法研究P16基因对喉细胞周期、形态、生长等特性的影响。结果 感染P16基因的Hep-2细胞内有源外源性P16基因的表达，细胞周期明显变化，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞有退行性改变，重组体腺病毒能介导外源基因P16在喉癌Hep-2细胞系中高效表达。重组体腺病毒介导的P16在Hep-2细胞系中表达，能抑制Hep-2细胞系的生长，流式细胞仪计数和细胞DNALadder证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生调亡并导致G1期阻滞。结论 P16基因抑制喉癌细胞系Hep-2的生长可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞而发挥作用。     

紫杉醇对人喉鳞状细胞癌Hep-2放射增敏作用的实验研究

目的 在体外用细胞生物学实验技术了解紫杉醇联合直线加速器X射线照射对Hep-2细胞株的作用，以及紫杉醇对Hep-2细胞株细胞周期的影响，并探讨其作用机制。方法 ①用MTT法计算Hep-2细胞经直线加速器照射组；先紫杉醇作用12、18、24、30h后再直线加速器照射组；先直线加速器照射再联合紫杉醇作用12、18、24、30h组各组细胞生长抑制率。②应用流式细胞仪检测Hep-2细胞经紫杉醇作用12、18、24、30h后各组细胞周期分布。结果 ①先紫杉醇作用再直线加速器照射组细胞生长抑制率较高（各组均值达到87．51％～89．64％），与先照射再联合紫杉醇组细胞生长抑制率（各组均值为57．84％～64．34％）及单纯照射组细胞生长抑制率（均值为41．90％）相比有统计学意义（P〈0．01）。②用紫杉醇后Hep-2细胞株细胞周期停滞于G2／M期，G2／M期停滞于24-30h达到峰值（24．65％～25．15％），并在用药后30h观察到凋亡峰。结论 紫杉醇有放射增敏作用，其可能机制是使细胞生长停滞于射线敏感期G2／M期，从而加强射线对肿瘤细胞的杀伤效应。     

Arsenic trioxide induced endoplasmic reticulum stress in laryngeal squamous cell line Hep-2 cells

Arsenic trioxide (As₂O₃) has been used in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL) and many malignant solid tumors. Recently, endoplasmic reticulum (ER) stress plays an important role in As₂O₃-treated laryngeal squamous cell line Hep-2 cells. In the present work, the expression of ER stress-related proteins was investigated in As₂O₃-treated Hep-2 cells. The results showed that As₂O₃ increased the expression of GRP78, CHOP, phosphorylated eIF2α and ATF4, all of which are the molecule of ER stress. Therefore, As₂O₃ induced ER stress in Hep-2 cells.     

美洛昔康对人喉癌Hep-2细胞株作用的研究

目的探讨美洛昔康对喉癌细胞株Hep-2凋亡作用和对体外培养喉癌Hep-2细胞周期的影响及作用机制。方法应用肿瘤细胞培养技术,随机分实验组和空白对照组,培养不同时间后,用流式细胞仪检测美洛昔康对Hep-2细胞凋亡发生率及对细胞周期的影响,同时检测美洛昔康作用Hep-2细胞后细胞线粒体跨膜电位的变化。结果流式细胞仪分析显示美洛昔康呈浓度依赖性诱导Hep-2细胞凋亡,且实验组G1期细胞数明显增加,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;实验组Hep-2细胞线粒体跨膜电位明显下降,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论美洛昔康具有诱导Hep-2细胞凋亡及抑制细胞分化的作用,其机制可能与触发了线粒体凋亡途径有关。     

肾上腺髓质素对于喉癌细胞的增殖作用

目的观察肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)对于喉癌细胞系Hep-2的促进增殖作用。方法采用氚胸腺嘧啶(H3-thymidine,H3-TDR)掺入方法观察不同药物作用下ADM对于喉癌细胞系Hep-2增殖的影响。结果在ADM浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L时均可以显著促进Hep-2细胞增殖(t=-2654.8、P<0.01,t=-1732.3、P<0.01和t=-836.5、P<0.01),三组浓度的ADM促进Hep-2增殖作用差别有显著性(F=18.5,P<0.01),且有剂量依赖性(r=0.9996,P<0.01)。加入ADM受体阻断剂ADM(22-52)Hep-2细胞的H3-TDR掺入量与单纯ADM孵育组掺入量差别有显著(t=2721.5,P>0.05)。Hep-2细胞经ADM孵育后分别加入丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-acti-vatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinase,MAPK/MEK)阻断剂PD098059、蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)阻断剂H-89、H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组掺入量差别有显著意义(t=2723.8,P<0.01、t=2095.2,P<0.01〉;但加入P38MAPK通路阻断剂SB202190后,H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组差别无显著性。(t=121.83,P>0.05)。结论肾上腺髓质素对于喉癌细胞Hep-2的增殖有促进作用,阻断ADM受体后Hep-2细胞生长受抑制,ADM促进Hep-2细胞生长信号可以通过MEK、PKA通路起作用,未发现p38MAPK参与该作用。     

RNA干扰沉默Aurora-A基因抑制喉癌Hep-2细胞生长的实验研究

目的 研究RNA干扰沉默Aurora-A基因后对喉癌Hep-2细胞体外体内生长的抑制作用.方法 构建靶向Aurora-A的小干扰RNA(siRNA)表达质粒并转染喉鳞癌Hep-2细胞株,采用CCK-8实验、Transwell实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠体内接种观察Aurora-A沉默后Hep-2细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力以及体内肿瘤生长情况,Western blot和免疫组化检测参与细胞黏附侵袭的重要因子黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达情况.结果 Hep-2细胞转染Aurora-A siRNA 后,siRNA-3实验组的Aurora-A蛋白的表达下降了52％,CCK-8实验中siRNA-3组细胞的平均(x±s)吸光度值为(3.268±0.106),低于Hep-2细胞组的(3.722 ±0.152),差异有统计学意义(F=17.634,P＜0.01);Transwell实验显示,siRNA-3组每个视野的平均侵袭细胞数目为(110.0±18.0)个,较Hep-2组的(236.0 ±26.0)个减少,两组差异有统计学意义(F=26.462,P＜0.01);克隆形成实验中,siRNA-3组平均集落数目(31.0±6.6)个,低于Hep-2组平均细胞集落数目(104.0±14.0)个(F=75.321,P＜0.001).接种后,体内移植瘤生长受到抑制,siRNA-3组的肿瘤平均体积为(127.77±174.83) mm3,低于Hep-2组的肿瘤平均体积(837.26±101.80) mm3(F=28.187,P＜0.001).在体外和体内黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达也下降.结论 抑制Aurora-A基因后,通过降低黏着斑激酶和基质金属蛋白酶-2的表达,抑制Hep-2细胞的生长,减弱肿瘤细胞的恶性侵袭性,Aurora-A可以成为喉鳞癌治疗良好的干预靶点.     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

DRB对人喉癌Hep-2细胞系中PK-CK2 mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系

目的探讨5,6-二氯-1--βD-呋喃核糖苯并咪唑(DRB)对人喉癌Hep-2细胞系中蛋白激酶CK2(PK-CK2)mRNA表达的影响及其与细胞凋亡的关系。方法不同浓度的DRB作用于人喉癌Hep-2细胞后,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平的变化,采用流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡率的变化。结果随着DRB浓度的增加或作用时间的延长,Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平呈下降趋势,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),流式细胞术检测二倍体峰前出现凋亡峰,5、10、20、40、80μmmol/L DRB与Hep-2细胞共育2h后的细胞凋亡率分别为0.68%、1.17%、7.25%、10.40%、22.66%。结论DRB可下调Hep-2细胞PK-CK2 mRNA表达水平,诱导细胞凋亡,这些可能是DRB抗癌作用的重要机制之一。