用聚合酶链反应检测人肝细胞癌乙型肝炎病毒DNA和丙型肝炎病毒RNA

为研究乙型肝炎病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）和丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＤＮＡ）与肝细胞癌的关系，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和巢式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）分别检测４２例肝肿瘤组织中ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ。结果：１例胆管细胞癌组织ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阳性，１例胆管囊腺瘤ＨＢＶＤＮＡ阳性。４０例肝细胞癌组织中，单纯ＨＢＶＤＮＡ阳性１９例，单纯ＨＣＶＲＮＡ阳性３例，二者均阳性１０例。ＨＢＶＤＮＡ阳性率７２．５％，ＨＣＶＲＮＡ阳性率３２．５％。ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ感染与肝癌组织学分型无关；且肝细胞癌中ＨＣＶ感染与ＨＢＶ未见相关。结果提示，我国ＨＢＶ感染仍是引起肝细胞癌的主要原因。但由于肝细胞癌患者中ＨＣＶ的感染率也较高，且有上升趋势，因此ＨＣＶ可能也是肝细胞癌发生的重要原因之一。     

套式PCR检测HBV与HCV垂直传播的比较研究

用套式ＰＣＲ法检测了２７例ＨＢｓＡｇ阳性母亲的新生儿脐带血ＨＢＶ ＤＮＡ，阳性３例（１１．１％），同时检测了７例抗－ＨＣＶ阳性母亲的新生儿脐带血ＨＣＶ ＲＮＡ及抗－ＨＣＶ，结果ＨＣＶ ＲＮＡ无１例阳性，抗－ＨＣＶ全部阳性，因此认为婴儿体内抗－ＨＣＶ是一种由母体被动获得的抗体，不能作为ＨＣＶ感染的客观指标。     

利用双扩增聚合酶链反应检测非甲非乙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒RNA

利用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’－端序列合成两对引物，建立了灵敏、特异的ＨＣＶＲＮＡ双扩增聚合酶链反应检测方法。用此方法及第二代Ａｂｂｏｔｔ酶联抗－ＨＣＶ检测试剂盒，检测了４４例非甲非乙型肝炎患者血清及１０名抗－ＨＣＶ阴性健康人。在４４例患者中，４１例（９３％）ＨＣＶＲＮＡ阳性，３６例（８２％）抗－ＨＣＶ阳性，３３例（７５％）ＨＣＶＲＮＡ、抗－ＨＣＶ全部阳性。３例ＨＣＶＲＮＡ阴性，但抗－ＨＣＶ阳性，另外，有８例抗－ＨＣＶ阴性，ＨＣＶＲＮＡ阳性。１０名健康人ＨＣＶＲＮＡ均为阴性。结果表明，大部分（９２％）抗－ＨＣＶ阳性患者带有ＨＣＶ，但为了检测所有病毒血症患者，抗－ＨＣＶ检测是不够的，利用双扩增ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ对于抗－ＨＣＶ阴性患者的诊断是非常有用的。     

输血后丙型肝炎与抗丙型肝炎病毒（HCV）阳性献血？…

采用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）和Ｃ区具有型特异性的引物建立的逆转录－聚合酶链反应方法检测了２５例丙型肝炎（ＨＣ）和２６例抗－ＨＣＶ阳性献血员的ＨＣＶ ＲＮＡ及基因型。结果２５例ＨＣ患者ＨＣＶ ＲＮＡ阳性率为１００．０％，２６例抗－ＨＣＶ阳性献血员ＨＣＶ ＲＮＡ阳性率为８４．５％，（２２／２６）。２５例ＨＣ中Ｉ、Ⅱ和混合型（Ｉ＋Ⅱ、Ⅱ＋Ⅲ、Ｉ＋Ⅲ、Ｉ＋Ⅱ＋Ⅲ）分别占８．０％     

从基因分型看血液透析及肾移植患者丙型肝炎病毒感染状况

采用国产和美国Ｏｒｔｈｏ公司第２代抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）试剂对１００例维持性血透及肾移植患者进行血清丙型肝炎病毒抗体（抗－ＨＣＶ）对比检测。阳性标本用聚合酶键反应（ＰＣＲ）法检测ＨＣＶＲＮＡ并采用型特异的ＨＣＶ亚基因探针对其非结构蛋白ＮＳＳ区扩增产物进行了杂交基因分型。结果表明，这组病人中抗－ＨＣＶ阳性率为４１％，肾移植术后再透析者达５６．５２％，且与透析时间、输血次数、受血量成正相关；国产抗－ＨＣＶ试剂同美国Ｏｒｔｈｏ公司试剂比较阳性符合率达９１．４３％；抗－ＨＣＶ阳性患者中有３１．４３％（１１／３２）血清ＨＣＶＲＮＡＮＳ５阳性；透析患者中，ＨＣＶ基因型各型均有，以混合型为主，占６３．６４％。     

中国湖南株丁型肝炎病毒cDNA（443－870）片段的克隆和序列分析

取１例湖南丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ＲＮＡ阳性血清，经强变性剂法抽提ＨＤＶＲＮＡ，逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增，扩增的ＨＤＶＣＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１８质粒中，获得了中国湖南株ＨＤＶＣＤＮＡ（４３３－８７０）片段克隆，ＤＮＡ测序结果显示，该片段（４３８ｈｐ长，包括一端ＰＣＲ引物２５ｈｐ）与已知的美国、意大利、法国、诺鲁和中国台湾５株ＨＤＶｃＤＮＡ相同片段比较，同源性分别为９１．３％，９４．５％，９１．３％，８４．５％和８９．３％，其中与ＨＤＶＲＮＡ复制密切相关的第一个高度保守区与美国株、意大利株和法国株完全同源。     

52 例病毒性肝炎患者肝组织中丙型肝炎病毒 RNA 和 HCAg-NS3 的测定

应用地高辛标记探针原位杂交法和单克隆抗ＨＣＶ－ＮＳ３－ＨＲＰ建立直接酶标免疫组化法分别测定５２例肝炎患者肝组织ＨＣＶＲＮＡ和ＨＣＡｇ－ＮＳ３。结果抗ＨＣＶ阳性组ＨＣＶＲＮＡ检出率５７．１％（１６／２８），ＨＣＡｇ－ＮＳ３检出率５３．６％（１５／２８）；抗ＨＣＶ阴性组其两项检出率均为１２．５％（３／２４）。肝组织中ＨＣＶＲＮＡ阳性物呈蓝紫色细小颗粒存在于肝细胞核或胞浆内，其在肝小叶中的分布可分为３型，即弥漫型、局灶型、散在型。肝组织中ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性物呈棕黄色细小颗粒分布于肝细胞核或胞浆内，以单个或数个阳性细胞散布于肝小叶中。２３例ＨＣＶＲＮＡ或／和ＨＣＡｇ－ＮＳ３阳性病例以肝炎后肝硬化（ＬＣ）病例占多数（１４／２３），其次为慢性重型肝炎（ＣＳＨ）和中度慢性肝炎（ＣＡＨ）。此两种检测方法具有较高符合率（９０．４％，４７／５２），表明病毒核酸及其表达产物均存在于肝细胞内，与ＨＣＶ感染密切相关。这为ＨＣＶ感染诊断提供了直接依据，有利于研究ＨＣＶ感染中病毒复制、慢性化进程、抗病毒治疗监测及重叠感染时病毒相互关系。     

丙型肝炎病毒感染者中抗病毒IgM检测的意义

建立了抗ＨＣＶＩｇＭ间接ＥＬＩＳＡ方法，并用之检测ＨＣＶ不同感染人群。抗ＨＣＶＩｇＭ在不同感染人群中的检出率变化很大。急性输血后丙型肝炎患者检出率可高达９３．８％，而正常献血员中可低至０．６８％。比较抗ＨＣＶＩｇＭ和抗ＬｇＧ阳性中ＨＣＶＲＮＡ的检测结果发现，抗ＩｇＭ阳性者中，不同ＨＣＶ感染人群的ＨＣＶＲＮＡ检出率很高（９３．０％～１００％）；而ＩｇＧ阳性者中ＨＣＶＲＮＡ的检出率变化很大（３７．５％～９３．８％）。在４３例血液透析者中抗ＩｇＭ与ＨＣＶＲＮＡ检测的一致性为８３．７％；抗ＩｇＭ与抗ＩｇＧ检测的一致性为８８．４％，结果提示：（１）抗ＨＣＶＩｇＭ与ＨＣＶ活跃复制有关，（２）抗ＨＣＶＩｇＭ与抗ＨＣＶＩｇＧ检出不完全一致。因此，临床检测抗ＨＣＶＩｇＭ有其特殊意义。     

丙型肝炎患者血清抗丙型肝炎病毒抗体IgM及HCVRNA检测结果的比较

用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对住院病人抗丙型肝炎病毒抗体（抗－ＨＣＶ）阳性血清标本进行抗－ＨＣＶＩｇＭ的检测，并与ＨＣＶＲＮＡ检测结果比较。结果表明，ＨＣＶＲＮＡ阳性、抗－ＨＣＶ阳性，ＨＣＶＲＮＡ阳性、抗－ＨＣＶ阴性及ＨＣＶＲＮＡ阴性、抗－ＨＣＶ阳性三种类型中均有抗－ＨＣＶＩｇＭ阳性者。结果还表明ＨＣＶＲＮＡ阳性病例的抗－ＨＣＶＩｇＭ阳性率明显高于ＨＣＶＲＮＡ阴性的病例（Ｐ＜０．０５），在临床诊断上ＨＣＶＲＮＡ阳性与阴性病例的肝病大多数为急性肝炎（ＡＨ）和慢性活动性肝炎（ＣＡＨ），ＨＣＶＲＮＡ阳性与阴性比较，各类肝病的病例数无明显差别。     

乙/丙型肝炎病毒双重感染患者前C区终止变异低频率

目的了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）双重感染患者前Ｃ区基因变异，及其可能的临床意义。方法用聚合酶链反应（ＰＣＲ）与限制片段长度多态性（ＲＦＬＰ）来分析２５例ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阳性（Ａ组）和３１例ＨＢｓＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ阳性但抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ均阴性（Ｂ组）的慢性肝病患者前Ｃ区密码２８终止变异（终２８）。结果ＨＢＶ和ＨＣＶ双重感染患者（Ａ组）血清ＨＢＶＤＮＡ第１次ＰＣＲ阳性率（１６％）明显低于单独ＨＢＶ感染组（６５％）（Ｐ＜０．００１）；前Ｃ终２８检出率（２８％）亦明显低于单独ＨＢＶ感染（６８％）（Ｐ＜０．００１）。结论提示双重感染患者ＨＢＶ前Ｃ终止变异低频率可能与ＨＢＶ低水平复制有关     

血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎的病原学研究

目的对血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎进行病原学研究。方法用ＨＢＶＰＣＲ、ＨＣＶＲＴ－ＰＣＲ和ＨＥＶＲＴ－ＰＣＲ分别检测血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎患者血清，并对其部分阳性产物进行克隆测序。结果８７例非甲～戊型肝炎血清ＨＢＶＤＮＡ均为阴性，９例（１０．３％）为ＨＣＶＲＮＡ阳性，部分经测序证实为ＨＣＶ１ｂ亚型；余７８例为ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ均阴性。该７８例中，１４例因无血清未作ＨＥＶＲＮＡ检测，余６４例中４９例（７６．６％）为ＨＥＶＲＮＡ阴性，１５例（２３．４％）为ＨＥＶＲＮＡ阳性。经序列分析显示，其中９例为典型的中国ＨＥＶ株基因序列，６例变异较大，与典型的中国株基因序列的同源性仅为８０％左右。４９例ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ和ＨＥＶＲＮＡ均阴性的血清中１６例（３２．６％）ＨＧＶＲＮＡ阳性。由此可见，该８７例中至少有９例为ＨＣＶ感染，１５例为ＨＥＶ感染，１６例为ＨＧＶ感染。结论对血清学标志阴性的非甲～戊型肝炎的病人应该用ＰＣＲ法进行病原学分型，以明确其诊断     

聚合酶链反应鉴定丙型肝炎病毒母婴传播的状态及其意义

采用多种方法，动态检测了１１例丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染的孕妇所生的婴儿血抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ。发现用合成肽酶联免疫吸附试验（ｓｐＥＬＩＳＡ）检测婴儿抗－ＨＣＶ阳性率（２３．５２％）显著低于第二代重组抗原ＥＬＩＳＡ（２ｎｄＥＬＩＳＡ）（４１．１８％）（Ｐ＜０．０５）；用２ｎｄＥＬＩＳＡ检测，６例婴儿脐血和静脉血抗－ＨＣＶ阳性，５例持续１～５月阴转，１例阳性持续１３个月。经重组免疫印迹试验（ＲＩＢＡ）鉴定，４例阳性，２例可疑阳性。用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ，５例阳性，３例于生后１～６个月自然阴转，２例持续阳性分别达９个月和１３个月。提示检测抗－ＨＣＶ判断ＨＣＶ母婴传播的状态受到婴儿抗－ＨＣＶ产生水平低下、母体抗－ＨＣＶ的被动输入和不同检测方法的影响，用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ是判断母婴传播更可靠的指标。     

肝病患者血清抗HCV及HCVRNA的检测与意义

利用第２代抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂和ＰＣＲ技术对１８６例肝病患者进行了抗ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ检测。６３例患者（３３．８７％）抗ＨＣＶ和／或ＨＣＶＲＮＡ阳性，表明本组肝病患者存在较严重的ＨＣＶ感染，ＨＣＶ标志物（ＨＣＶｍ）阳性肝病患者较ＨＣＶｍ阴性肝病患者有更高的输血，手术，接种和拔牙等血液暴露史（Ｐ〈０．０５或Ｐ〈０．０１）。６３例ＨＣＶ感染者中，３４例抗ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ同时阳性，另有患者表现为     

丙型肝炎患者血清抗丙型肝炎病毒性抗IgM及HCVRN…

用酶联免疫吸附试验对住院病人抗丙型肝炎病毒抗体阳性血清标本进行抗－ＨＣＶＩｇＭ的检测，并与ＨＣＶＲＮＡ检测结果比较。结果表明，ＨＣＶＲＮＡ阳性、抗－ＨＣＶ阳性，ＨＣＶＲＮＡ阳性，抗－ＨＣＶ阴性及ＨＣＶＲＮＡ阴性，抗－ＨＣＶ阳性三类型中均有抗－ＨＣＶＩｇＭ阳性者。     

地高辛标记探针原位杂交检测肝内HDV RNA

本研究采用随机引物法用地高辛标记ＨＤＶ　ｃＤＮＡ全基因片段作为探针，通过原位杂交方法检测了５８例慢性乙型肝炎患者的肝组织石蜡切片中的ＨＤＶ　ＲＮＡ，发现ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性者９例，检出率为１５．５％。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性物质在肝细胞内的分布方式有胞浆型、核膜型、核仁型、核膜核仁型和全核型等。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性肝细胞在显微镜下多数正常或只显示轻微病变。本文结果提示ＨＤＶ的致病性并非由于ＨＤＶ的直接细胞毒作用，而是宿主细胞和病毒共同作用结果，但其确切生物学意义还有待进一步探索。     

原位杂交法检测肝组织中丁型和乙型肝炎病毒核酸

利用国外引进的重组质粒获得纯化基因片段，分别以随机引物法和ＰＣＲ法制备地高辛素标记的ＨＢＶＤＮＡ探针和ＨＤＶｃＤＮＡ探针。用原位杂交法检测了石蜡包埋的肝组织切片ＢＶＤＮＡ和ＨＤＶＲＮＡ。４９例感染肝组织分为两组：丁肝组２３例；单纯乙肝组２６例，ＨＢＶＤＮＡ的检出率丁肝组（７８．２６％）与乙肝组（７６．９２％）无统计学差异；而ＨＤＶＮＡ的检出率丁肝组（６０．８７％）明显高于乙肝组（１５．３８％）。ＨＢＶＤＮＡ可见于受染肝细胞的胞核或胞浆内，而ＨＤＶＲＮＡ绝大部分见于肝细胞胞核。两种病毒核酸阳性细胞在肝组织中的分布特点大致相同：弥漫或散在地分布于肝小叶或假小叶内，或局灶性分布于小叶周边。ＨＤＶＲＮＡ阳性的肝组织都或多或少地同时存在ＨＢＶＤＮＡ。同一例肝组织中，ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞从数量和颗粒密度上似略高于ＨＤＶＲＮＡ。将乙肝组和丁肝组两组病人肝内ＨＢ－ｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ及血清ＨＢｅＡｇ作了比较，各指标阳性率虽有差异，但均无统计学意义。因此，未发现ＨＤＶ感染对ＨＢＶ的复制有明显抑制作用。此结果对以往用血清学或免疫组化方法对ＨＤＶ的研究有所补充和深入，亦可为研究其它类型病毒性肝炎之间的重叠感染所借鉴。     

全血与血液制品中HCV RNA检测及其基因分型的初步研究

对一组临床应用的全血（配血用标本）、血液制剂与丙种球蛋白制剂进行检测。血浆制剂抗ＨＣＶ阳性率显著高于全血（３２．６４％与１１．６８％、Ｐ＜０．０１）。三组标本中抗ＨＣＶ阳性者ＨＣＶ ＲＮＡ检出率基本相似。但丙球制剂组ＨＣＶ ＲＮＡ阳性标本在ＰＣＲ中的反应强度显著低于前两者。对部份标本作ＨＣＶ基因亚型检测，三组总体ＨＣＶ亚型表达频率为，原型：２．９４％；Ｋ１：４７．０６％；Ｋ２ａ：３２．３５％；Ｋ２     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及其临床意义。方法应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶＤＮＡ浓度。结果ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝５０μｌ（下同），ＬＣ为４．５５，ＰＨＣ为４．４３，三组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；血清ＨＢＶ五项免疫标志均阴性或抗－ＨＢｓ阳性的慢性肝病患者中，有３７．５％患者存在低水平ＨＢＶ复制；ＨＢｅＡｇ阳性患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度总体上明显高于抗－ＨＢｅ阳性组，但其中部分患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度也很高。结论提示ＨＢＶ的复制状态与慢性肝病的病期无明显关系；在抗－ＨＢｅ阳性的患者中存在个体差异，故不能仅依据抗－ＨＢｅ阳转来判断ＨＢＶ复制减少或停止。     

巨细胞病毒宫内感染的诊断及对胎儿的影响

采用地高辛探针斑点杂交技术和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，对５１例人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）血清学抗体ＩｇＭ阳性孕妇的羊水、脐血和产后两周内的新生儿尿液，进行ＨＣＭＶＤＮＡ检测。同时与酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测脐血、羊水中ＨＣＭＶ－ＩｇＭ的结果相比较。结果，地高辛探针斑点杂交检测ＨＣＭＶ－ＤＮＡ的阳性率分别为：羊水２１．５７％，脐血３３．３３％，新生儿尿液２７．４５％。ＰＣＲ检测ＨＣＭＶ－ＤＮＡ的阳性率分别为：羊水２９．４１％，脐血４３．１４％，新生儿尿液３Ｓ，２９％。羊水ＨＣＭＶ－ＩｇＭ阳性率为１１．７６％，脐血ＨＣＭＶ－ＩｇＭ阳性率为２３．５３％。脐血ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性的新生儿平均出生体重明显低于脐血ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阴性的新生儿，而脐血ＨＤＷ－ＤＮＡ阳性的新生儿肝功能异常、血小板减少以及低Ａｐｇａｒ评分的发生率明显高于脐血ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阴性的新生儿。结果表明：采用ＥＲ技术检测羊水、脐血或产后两周内新生儿尿液ＨＣＭＶＤＮＡ有助于ＨＣＭＶ官内感染的早期诊断，便于临床早期干预，ＨＣＭＶ官内感染严重影响胎儿的生长发育，可造成胎儿肝功能异常、血小板减少和新生儿窒息的发生。     

检测丁型肝炎病毒RNA打点杂交法的建立及其应用

经缺口平移法以ａ－３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记１．０ｋｂ的丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）ｃＤＮＡ片段为探针，采用蛋白酶Ｋ直接从血清中提取ＨＤＶＲＮＡ，建立了检测血清中ＨＤＶＲＮＡ的打点杂交法，其灵敏性可达１ｐｇ水平，与乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ无交叉杂交反应；并应用于检测我国５９４９份ＨＢｓＡｇ阳性血清中的ＨＤＶＲＮＡ，共检出１７６份ＨＤＶＲＮＡ阳性，检出率为２．９５％。