靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

Stat3反义核苷酸通过调节凋亡相关因子诱导喉癌细胞凋亡

目的:探讨反义Stat3基因诱导喉癌细胞凋亡的机制。方法:将设计好的已证实能诱导人喉癌细胞凋亡的Stat3反义寡核苷酸序列,应用脂质体瞬时转染法转染人喉癌Hep-2细胞,应用Western blot、PCR检测Hep-2细胞中Bcl-2,Bax及C-Myc基因及蛋白的表达情况。结果:Western blot和RT-PCR结果显示转染Stat3反义寡核苷酸细胞组,Bax的表达随反义寡核苷酸浓度增加,表达增强,而Bcl-2及C-Myc的表达则减弱。结论:反义Stat3寡核苷酸通过上调Bax,下调Bcl-2及C-Myc基因表达来参与其诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡的过程。     

EGCG对鼻咽癌细胞株CNE-2及相关基因表达的影响

目的:研究EGCG对鼻咽癌细胞系CNE-2的增殖与凋亡作用,探讨其对细胞增殖与凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。方法:应用MTT实验、流式细胞仪检测细胞的增殖与周期;Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡;RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。结果:EGCG明显抑制CNE-2细胞的增殖,诱导其凋亡,该作用具有剂量-效应关系。EGCG抑制CNE-2细胞Bcl-2表达,诱导CNE-2细胞Bax、Caspase-3表达。结论:EGCG在体外具有抗鼻咽癌细胞的作用,此作用可能是通过调节细胞增殖与凋亡基因的表达实现的。     

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的　探讨RNA干扰技术（RNAi）沉默肺腺癌转移相关转录本-1（MALAT-1）基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路影响。方法  体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bax、caspase-3 mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）及其磷酸化蛋白（p-PI3K）、Akt及其磷酸化蛋白（p-Akt）蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果　与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（3.24±1.02）升高（P＜0.05）;与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1 mRNA表达水平（0.47±0.08）及Bcl-2 mRNA（0.56±0.09）及蛋白（0.31±0.05）表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[（20.48±3.41）%]均升高,Bax、caspase-3mRNA（3.02±0.50、2.58±0.43）及蛋白表达（0.86±0.14、0.94±0.16）均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达（0.57±0.10、0.51±0.08）均降低（P 均＜0.05）。结论　MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。     

塞来昔布联合放射对鼻咽癌细胞株凋亡的影响

目的 探讨塞来昔布联合放射对人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡的影响及其可能的机制.方法 实验分4组进行,分别为对照组、药物组(25μmol/L塞来昔布)、照射组(8 Gy X线)和实验组(25 μmol/L塞来昔布+8 Gy X线照射).克隆形成实验检测塞来昔布对CNE-2Z细胞的放射增敏作用;流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率;免疫细胞化学染色检测B淋巴细胞-2(Bcl-2)、凋亡活化基因(Bax)蛋白表达;Western blot技术检测Caspase-3蛋白表达.结果 塞来昔布对人鼻咽癌细胞CNE-2Z有放射增敏作用,实验组中CNE-2Z细胞平均存活分数为0.50,细胞平均致死剂量为2.36,与对照组比较差异有统计学意义(P值均＜0.01);塞来昔布联合放射能够上调Bax的蛋白表达,对照组Box表达评分为1.221 ±0.116,实验组为2.758±0.256;同时抑制Bcl-2蛋白表达,对照组Bel-2表达评分为2.559±0.144,实验组为1.253±0.114,差异均有统计学意义(P值均＜0.05);并明显增加肿瘤细胞的凋亡率(F=7.63,P＜0.01),差异有统计学意义;Western blot结果显示实验组Caspase-3蛋白表达增强.结论 Cox-2抑制剂塞来昔布联合放射能诱导人鼻咽癌细胞株CNE-2Z凋亡,具有放射增敏作用.

Abstract：

Objective To investigate the effects of celecoxib combined with radiotherapy on apoptosis of CNE-2Z cell lines and the potential mechanisms.Methods Four groups were used,a control,celecoxib (25 μmol/L celecoxib) ,irradiation ( 8 Gy X ray) and celecoxib plus irradiation.The radiosensitising effect was detected by clone formation experiment.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells.The expressions of Bcl-2 and Bax were assessed by immunocytochemistry.Western blot was used to examine the expression of Caspase-3.Results Celecoxib enhanced the radiosensitivity of CNE-2Z cells.In experimental group,the mean surviving fraction and the mean lethal dose of CNE-2Z cells were 0.50 and 2.36 respectively.Compared with the irradiated group,there was significant differences between the two groups (P ＜ 0.01 ).Celecoxib combined with radiotherapy up-regulation the expression of Bax.The score of the expression of Bax in the control group and the experimental group were 1.221 ±0.116 and 2.758 ±0.256 respectively.Celecoxib combined with radiotherapy could inhibit the expression of the protein of Bcl-2.The score of the expression of Bcl-2 in the control group and the experimental group were 2.559 ± 0.144 and 1.253 ± 0.114 respectively,with significant differences ( P ＜ 0.01 ).Celecoxib combined with radiotherapy cound increase the apoptosis rate of tumor cells with significant differences ( F =7.63,P ＜ 0.01 ).Western blot showed that the expression of Caspase-3 was strengthened.Conclusion Celecoxib combined with radiotherapy could induce apoptosis and enhance the radiosensitivity of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cell lines.     

白细胞介素-24对喉癌细胞的增殖抑制效应及机制

目的：研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（Ad—mda-7／IL-24）基因对喉癌细胞Hep-2增殖抑制效应及机制。方法：将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以正常人脐静脉内皮细胞HUVEC为对照,采用RT-PCR方法检测Hep-2、HUVEC细胞中外源性hIL-24表达,以及Bcl-2和Bax的变化;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的生长和凋亡情况。结果：腺病毒介导的hIL-24mRNA能在Hep-2细胞和HuVEC细胞中表达;在Hep-2细胞中,抗凋亡分子Bcl-2表达降低,而促凋亡分子Bax表达增强;在HUVEC细胞中Bcl-2表达没有变化,Bax表达有所增强。MTT法显示Ad—hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长。在Hep-2细胞中,显微镜下可见明显的细胞凋亡。结论：Ad—hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制研究

目的 探讨姜黄素联合白藜芦醇抑制人头颈部肿瘤细胞系增殖的机制。 方法 用姜黄素和白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌细胞株)及FaDu(人下咽癌细胞株),应用MTT(塞唑蓝)比色法检测细胞增殖抑制率,平板克隆增殖实验检测单个细胞集落形成能力,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,同时应用Real-time PCR法检测Bax和Bcl-2 的mRNA 表达水平。 结果 姜黄素和白藜芦醇对Hep2和FaDu细胞增殖有抑制作用,二者联合处理后,对细胞增殖、细胞克隆形成能力及细胞凋亡的抑制均明显增强;同时,姜黄素和白藜芦醇上调细胞中Bax和下调Bcl-2的mRNA水平。 结论 姜黄素与白藜芦醇联合处理可抑制Hep2及FaDu细胞增殖,作用机制可能与上调Bax、下调Bcl-2基因表达有关。     

微小RNA-548c-3p通过靶向调控PCNA基因表达对喉癌细胞增殖及凋亡影响的研究[论著]

目的　探讨微小RNA-548c-3p（miR-548c-3p）对喉癌细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法　用miR-548c-3p mimic、增殖细胞核抗原（PCNA）-siRNA及其阴性对照分别或同时转染喉癌TU686和M4e细胞,用qRT-PCR与Western blot法检测miR-548c-3p和PCNA的表达;MTT法和流式细胞术分别检测转染细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因实验观察miR-548c-3p和PCNA的靶向关系。Western blot法检测PCNA、细胞周期蛋白1（CyclinD1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白（Bax）的表达。结果　miR-548c-3p的表达量在癌旁组织（0.74±0.10）、喉癌组织（1.94±0.16）,TU686细胞（0.35±0.07）和M4e细胞（0.41±0.03）中均呈低表达,而PCNA mRNA和蛋白均呈高表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）。证实PCNA上存在miR-548c-3p的结合位点。上调miR-548c-3p可抑制细胞增殖及CyclinD1、Bcl-2的表达,并可促进细胞凋亡及Bax的表达,差异有统计学意义（P 均＜0.05）;上调miR-548c-3与抑制PCNA对细胞增殖及凋亡的作用相似。pcDNA-PCNA显著减弱miR-548c-3p mimic对细胞增殖和凋亡的作用。结论　miR-548c-3p通过抑制PCNA表达而降低喉癌细胞增殖能力并诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默SOX2表达增强Hep-2化疗药物敏感性作用研究

目的：研究SOX2表达对人喉癌上皮细胞Hep-2化疗敏感性的影响。方法：设计合成RNAi-SOX2序列,瞬时转染Hep-2细胞,Westernblot法筛选沉默效率最好的RNAi-SOX2构建pGCsi-H1-SOX2质粒,并构建其对照质粒pGCsi-HI-NC,分别转染Hep-2细胞建立稳定沉默SOX2表达细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照细胞株psiNC-Hep-2。CCK-8法检测SOX2表达沉默对Hep-2细胞对化疗药物敏感性的影响;Hoechst染色法检测SOX2表达沉默对化疗药物诱导Hep-2细胞凋亡的影响;Westernblot法检测SOX2表达沉默对凋亡相关基因Survivin、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表达的影响。结果：成功获取SOX2表达沉默细胞株psiSOX2-Hep-2及其对照psiNC-Hep-2细胞株,与psiNC-Hep-2细胞相比,psiSOX2-Hep-2中SOX2表达下降78％。SOX2表达沉默后,psiSOX2-Hep-2细胞对5-FU和紫杉醇的敏感性均增强,psiSOX2-Hep-2细胞48h的IC50值分别下降到8．12ug／ml和5．16ug／ml;同时,psiSOX2-Hep-2细胞凋亡数增多;抗凋亡基因Survivin、Bcl-2表达下降明显,凋亡基因Bax、cleaved caspase-3表达显著上升。结论：RNAi沉默SOX2表达将显著增强人喉癌上皮细胞Hep-2对5-FU和紫杉醇的敏感性。     

罗格列酮对Hep-2细胞增殖的影响及机制研究

目的:探讨罗格列酮(ROS)对体外培养的人喉癌Hep-2细胞的增殖抑制作用及其机制。方法:应用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度ROS处理不同时间喉癌Hep-2细胞后细胞的增殖活性,制作生长抑制曲线。采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化。RT-PCR检测环氧化酶(COX-2)mRNA表达的变化。结果:ROS明显抑制人喉癌Hep-2的增殖,其作用表现为剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测发现:ROS阻滞Hep-2细胞于G0/G1期,并呈典型的凋亡特征性的亚G1峰,S期和G2/M期比例下降,其凋亡率呈时间依赖性上升(P<0.05)。RT-PCR检测发现人喉癌Hep-2细胞COX-2mRNA表达显著下降(P<0.01)。结论:ROS对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,其作用机制与阻滞细胞于G0/G1期和下调COX-2表达有关。     

葫芦素B对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:体内外观察葫芦素B对人喉癌细胞系Hep-2的抑制增殖和诱导凋亡作用并探讨其作用机制,为临床应用提供实验依据.方法:用0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24、48和72 h, MTT法检测细胞增殖.用0.1、1.0和10.0 μmol/L的葫芦素B作用于Hep-2细胞24 h或10 μmol/L葫芦素B作用8、12和24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡.Western blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用.结果:MTT结果显示葫芦素B对Hep-2 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测发现随着葫芦素B浓度增高或作用时间延长,处于G2/M期细胞的比例逐渐升高,同时伴有G0/G1期细胞减少,细胞凋亡率逐渐升高,经统计学分析,各实验组之间及其与对照组之间的均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);荧光显微镜观察可见典型细胞凋亡;Western blot检测显示葫芦素B可剂量依赖性抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达.体内实验发现低、中、高剂量组的抑瘤率分别是32.43%、43.24%和70.27%.结论:葫芦素B通过抑制STAT3活化,抑制cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达,引起喉癌细胞G2/M期阻滞、增殖抑制和凋亡,发挥对喉癌的抗癌效应.     

鼻息肉中诱导型一氧化氮合酶、Bax及Bcl-2的表达及相关性研究

目的:检测鼻息肉组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达及相关性。方法:30例鼻息肉组织,应用TUNEL方法检测其凋亡情况;免疫组织化学SABC法检测iNOS及Bax、Bcl-2的表达;western blot方法检测iNOS、Bax、Bcl-2的表达。结果:①TUNEL方法检测凋亡细胞位于鼻息肉表层上皮细胞及腺体上皮细胞,均为弱阳性。②免疫组织化学法检测iNOS、Bax、Bcl-2均表达于鼻息肉组织上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞和浸润的炎性细胞,阳性表达定位于细胞质,其中Bax表达为弱阳性,iNOS、Bcl-2表达为强阳性。③Western blot检测3种蛋白均有表达条带,iNOS、Bal-2条带清晰,Bax条带软弱,差异有统计学意义(P<0.01);iNOS与Bcl-2的灰度值比值呈正相关(r=0.851,P<0.01);iNOS与Bax的灰度值比值呈负相关(r=-0.714,P<0.01)。结论:鼻息肉组织中存在抗凋亡和促凋亡2种蛋白,iNOS抑制细胞凋亡,可能对鼻息肉的发生、发展起重要的促进作用。