肝星状细胞凋亡机制及调控研究进展

抑制活化肝星状细胞(HSCs)增殖和诱导其凋亡成为阻止肝纤维化(HF)进程的途径之一。在细胞凋亡的发生过程中,有多种不同因素和途径参与活化HSCs的凋亡,活化HSCs的凋亡受到凋亡和抗凋亡基因、细胞因子等调控。作者就近年来有关HSCs凋亡及其调控的研究进展作一综述。     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。     

肝星形细胞及相关细胞因子IFN、TNF在肝纤维化形成中的作用

肝纤维化的本质是肝脏内结缔组织的增生大于降解,从而引起细胞外基质过度沉积。肝星形细胞(HSCs)在这一过程中起到至关重要的作用,其活化和凋亡与肝纤维化形成及逆转密切相关。因此,寻找抑制HSCs活化、促进HSCs凋亡的途径是防治肝纤维化的重要策略。近年来对HSCs活化和凋亡的研究已取得了一些新的进展。本文简要综述了HSCs及相关细胞因子干扰素、肿瘤坏死因子在肝纤维化形成过程中的生物学作用。     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的 通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响.方法 大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100 nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组.MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCs Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量.结果 与空白对照组相比,1、10 nmo/L AcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10 nmol/L及0.1～100 nmoI/L AcSDKP的干预,分别显著抑制HSCs Col Ⅰ mRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10 nmol/L和0.1、1 nmol/L AcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达.结论 本实验发现,AeSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1 nmol/L时作用最为显著.其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关.     

丹参素对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响

目的 观察丹参素对IL-1β刺激的肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制.方法 用原位-密度梯度离心法提取肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs),以不同浓度的丹参素作用于IL-1β刺激的HSCs,MTT法、AO/EB免疫荧光和Annexin V-FITC/P1分别检测HSCs的增殖和凋亡;免疫细胞化学、ELISA法、Western blot分别检测Ⅲ型胶原的生成、NF-κB核转位及细胞质p-IκBet、细胞核NF-κB p65的表达.结果 与对照组相比,IL-1β刺激组HSCs增殖明显增加(P<0.01),凋亡率明显减低(P<0.05),Ⅲ型胶原的合成和分泌明显增加(P<0.01);不同浓度丹参素作用24 h后HSCs增殖明显减低(P<0.01),凋亡明显增加(P<0.01),以早期凋亡为主,Ⅲ型胶原的合成和分泌亦明显减少(P<0.05,P<0.01);Western blot结果显示IL-1β作用30 min时细胞质p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达明显增加(P<0.01),出现核转位;免疫细胞化学显示细胞核内p65阳性染色细胞增多浓染,提示IL-1β可以诱导HSCs的NF-kB活性;丹参素组细胞质p-h相似文献   

丹参素对IL-1β刺激的大鼠肝星状细胞JNK、NF-κB信号通道的影响

目的 观察丹参素对活化的大鼠肝星状细胞(HSC)氨基末端蛋白激酶(JNK)以及NF-κBP65表达的影响,探讨其抗肝纤维化作用的机制.方法 分离大鼠原代HSC,MTT法检测丹参素对细胞的生长抑制,免疫细胞化学法观察Ⅲ型胶原合成,ELISA法观察Ⅲ型胶原分泌.AO/EB荧光染色观察HSC凋亡形态学变化,Annexin-V-FITC/PI联合流式细胞仪检测HSC的凋亡率,Western blotting观察丹参素对IL-1β刺激的HSCs内P-IκBα、NF-κBP65和JNK蛋白的表达.结果 和结论丹参素可抑制活化的HSC增殖,降低胶原合成和分泌,促进HSC凋亡,并抑制IL-1β刺激的HSC中JNK的磷酸化及NF-κBp65的表达.     

乙醛及其刺激的Kupffer细胞对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨乙醛及其刺激的Kupffer细胞对大鼠肝星状细胞(HSCs)活化的影响.方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度法离心分离大鼠肝脏HSCs和Kupffer细胞,制备乙醛刺激的Kupffer细胞培养上清液(KCCM),并以MTT法观察乙醛及乙醛与Kupffer共同培养的KCCM对HSCs的增殖效应,以放射免疫法检测HSCs培养上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果 乙醛直接作用于HSCs后HSCs明显增殖,并能合成分泌Ⅳ型胶原;未用乙醛处理和经乙醛处理后的KCCM均能使HSCs增殖并生成Ⅳ型胶原,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 乙醛可促进HSCs活化,与酒精性肝病时肝纤维化的发生有关.乙醛不能直接作用于Kupffer细胞引起HSCs活化.     

人脂肪干细胞分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用

目的：分离培养脂肪干细胞（ADSCs）以探讨其分泌因子对HaCaT细胞的生物学作用.方法：从人腹部脂肪组织中分离并培养ADSCs3d后,ELISA法测定ADSCs分泌血管内皮生长因子（VEGF）,肝细胞生长因子（HGF）含量;收集ADSCs培养液（ADSC-CM）作用于HaCaT细胞株.采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖;AnexinV/PI双染色法测定HaCaT细胞的凋亡情况;体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果：培养获得ADSCs细胞3d后,培养液中VEGF、HGF含量分别为（287±47）,（577±85）ng/L.MTT实验30%ADSC-CM组、50%ADSC-CM组的A490nm值分别高于对照组,差异具有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）.实验组HaCaT细胞凋亡率明显低于对照组（P〈0.05）.与对照组相比较,实验组HaCaT细胞迁移距离36,48h时间点显著增大（P〈0.05或P〈0.01）.结论：ADSCs能分泌细胞因子且对HaCaT细胞具有促增殖、迁移和抑制凋亡作用.     

瘦素诱导人肝星状细胞活化及其作用机制

目的探讨瘦素通过何种机制诱导人肝星状细胞(HSCs)活化及其机制。方法采用瘦素处理体外培养HSCs细胞的方法,模拟高瘦素血症对肝纤维化影响的研究模型,经过不同时间和不同浓度的瘦素处理后,Western-blot方法检测TGF-β1、SREBP-1c、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达量。结果瘦素可以促进HSCs表达α-SMA、Ⅰ型胶原和TGF-β1的表达,而抑制SREBP-1c的蛋白表达。结论瘦素活化人肝星状细胞参与肝纤维化过程,其中机制可能与激活TGF-β1通路和抑制SREBP-1c表达有关。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

龙血素A对大鼠肝星状细胞增殖及Frizzled-4受体蛋白表达的影响

［摘要］目的　研究WNT信号通路中卷曲蛋白-低密度脂蛋白相关蛋白复合受体（Frizzled/LRP）在体外培养活化大鼠肝星状细胞（aHSCs）中的表达及龙血素A（Loureirin A）干预对大鼠肝星状细胞（aHSC）增殖及α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1分泌的影响,探讨龙血素A抗肝纤维化的细胞分子机制．方法　分离SD大鼠肝星状细胞,体外传代培养诱导细胞活化,倒置相差显微镜下观察肝星状细胞活化前后形态学变化,用不同浓度龙血素A处理活化的大鼠肝星状细胞（aHSCs）．MTT法测定龙血素A对肝星状细胞的生长抑制率;Western Blot方法从蛋白水平检测肝星状细胞中Frizzled-4受体蛋白;Elisa测定药物干预后细胞培养上清液中α-SMA和TGFβ1的含量．结果　与对照组相比,龙血素A抑制肝星状细胞增殖并有明显的时间-剂量效应关系,IC50=0.30 μg/μL;龙血素A在蛋白水平显著下调受体蛋白Frizzled-4表达,同时抑制肝星状细胞分泌α-SMA、TGFβ1（P＜0.05）．结论　Frizzled-4受体蛋白在活化的大鼠肝星状细胞（aHSCs）中高表达,经龙血素A干预后,Frizzled-4表达量明显降低,细胞增殖受到抑制,α-SMA、TGFβ1合成和分泌量下降,这提示龙血素A可能与WNT信号通路调节肝纤维发生和血管新生的分子机制相关．     

活化型肝星状细胞清除机制及其相关抗肝纤维化策略

已知肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化是肝纤维化的核心环节。越来越多的基础和临床研究证实,肝纤维化可以逆转。而肝纤维化消退的主要表现之一是活化型HSCs数量不断减少。因此,如何清除活化型HSCs并使之成为抗肝纤维化治疗新策略正逐渐受到关注。现有两种可能机制用于解释活化型HSCs的清除现象,即活化型HSCs的表型逆转和凋亡。本文旨在对基于活化型HSCs清除机制的抗肝纤维化策略进展做一综述。     

青蒿琥酯通过上调神经酰胺抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡

目的: 探讨神经酰胺与青蒿琥酯抗肝纤维化作用的关系。 方法:将培养的肝星状细胞分为实验组和对照组,实验组为不同浓度的青蒿琥酯处理组及神经酰胺处理组。以四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肝星状细胞（HSC）增殖率,Hoechst 33258荧光染色观察细胞调亡, Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,HPLC－FLD法测定青蒿琥酯处理后HSC培养上清中的神经酰胺（C2）的含量,均数比较采用单因素方差分析,两样本均数比较采用独立样本t检验。 结果: 不同浓度青蒿琥酯及神经酰胺对肝星状细胞均有明显抑制作用,且呈剂量-效应关系和时间-效应关系（P<0.01）,青蒿琥酯及神经酰胺均能诱导肝星状细胞的凋亡,青蒿琥酯能够上调细胞培养上清液中神经酰胺的含量。 结论: 青蒿琥酯可能通过上调神经酰胺抑制肝星状细胞的增殖并诱导其凋亡。     

肝星形细胞中细胞凋亡和存活的信号调控

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝脏纤维化发生过程中起着关键作用.当正常肝脏受到损伤时,HSCs由静息状态转分化为类肌成纤维细胞,并保持这种处于激活状态的表型,它们接收到的凋亡和存活的生物信号将决定激活态HSCs的最终细胞寿命.HSCs凋亡的发生与一系列复杂而又相互关联的生物信号传导和调控有关,HSCs凋亡信号来自于细胞膜受体,如死亡受体、神经生长因子受体和外周型苯甲二氮卓受体(peripheral-type benzodiazepine receptor);以及胞浆蛋白,如Bcl-2家族蛋白和细胞周期蛋白等.HSCs存活信号受到多种激酶和细胞因子的诱导,如金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue jnhibitors of metalloproteinase-1)、Rho/Rho激酶、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1)等.特异性地诱导HSCs发生凋亡是治疗肝脏纤维化的直接和有效手段,虽然目前对HSCs由激活态到静息状态的转归尚需进一步研究,但诱导HSCs凋亡将是治疗肝脏纤维化和肝硬化的研究热点和主要发展方向.     

桃红四物汤加丹参对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨桃红四物汤加丹参时活化的人肝星形细胞（HSC）增殖和凋亡的影响，阐明其时肝纤维化的防治作用。方法将人肝星状细胞体外培养，加入不同浓度桃红四物汤加丹参干预48h后，采用MTT法以及流式细胞仪检测其增殖及凋亡情况。结果桃红四物汤加丹参0．4mg／mL、0．2mg／mL两种浓度均能抑制肝星状细胞增殖，并能促进其凋亡。结论桃红四物汤加丹参具有抑制人肝星状细胞的增殖，诱导肝星状细胞凋亡的作用。可能为肝纤维化的中医药防治研究提供新的思路。     

一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

目的 探讨一种高效、经济、稳定的肝星状细胞的分离方法,为肝纤维化研究提供细胞模型.方法 应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流,以Nycodenz为分离介质,采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞.结果 肝星状细胞的获得率为（3.2±0.67）×107/只、存活率为90%以上.结论 该法是一种较理想的分离肝星状细胞的方法.     

细胞外信号调节激酶磷酸化对十字孢碱诱导肝星形细胞凋亡的调控

目的:肝星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs) 是参与肝纤维化和肝硬化发展过程的主要细胞。在肝纤维化过程中, 肝星形细胞增殖并发生表型转化, 从静止状态向肌纤维母细胞样转化。后者的归宿可为凋亡, 也可重归静止状态。目前转化肌纤维母细胞样细胞的凋亡机制尚未明确。本文研究细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERKs)磷酸化状态对十字孢碱诱导HSCs凋亡的影响。方法:采用Western 印迹和流式细胞术检测4种肝星形细胞株(CFSC-8B, -2G, -3H and-5H) 的ERKs表达水平和细胞凋亡状态。结果:4种肝星形细胞株各具有形态特异性, 并与其内α-SMA表达水平相符, 其中 CFSC-8B 细胞株 α-SMA表达水平为最高。虽然 ERK1/2 总蛋白表达水平在4种细胞株相似, 但磷酸化 ERK1/2在 CFSC-8B 和 CFSC-2G 2个细胞株中表达明显高于 CFSC-3H 和 CFSC-5H细胞株。进一步采用CFSC-8B 细胞(ERK1/2 高磷酸化水平)和 CFSC-5H 细胞(ERK1/2 低磷酸化水平), 通过staurosporine 诱导细胞凋亡。结果显示 CFSC-8B 细胞对staurosporine诱导的细胞凋亡敏感性明显增加。同时, staurosporine还可进一步增加这2株细胞内ERK1/2的磷酸化程度。结论:HSCs中ERK1/2 的磷酸化程度决定细胞对 staurosporine 所致细胞凋亡的敏感性。     

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的 通过观察不同浓度外源性一氧化氮（nitric oxide ,NO）供体硝普钠（SNP）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法 获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L、4.00 mmol/L）下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR（RT-PCR）方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1（TGF-β1）以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、 Ⅱ胶原蛋白（Col-Ⅱα1）基因的变化。结果 培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高（P<0.05）;与对照组相比,低浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L）对ADSCs的增殖无明显影响（P>0.05）,高浓度SNP（4.00 mmol/L）抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1 mRNA的表达,同时抑制Smad3 mRNA和Col-Ⅱα1 mRNA的表达。结论 在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。     

维拉帕米对肝星状细胞凋亡和Bcl-2/Bax表达的影响

目的:研究维拉帕米对人肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)凋亡的影响以及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达的变化.方法:CCK-8法检测不同浓度的维拉帕米处理48 h对HSCs细胞增殖的抑制作用;漉式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测HSCs细胞的凋亡率;免疫组化SABC法检测Bcl...