DNA末端原位标记技术研究慢性再生障碍性贫血骨髓CD_(34)~+细胞凋亡

目的　观察慢性再生障碍性贫血 (CAA)患者骨髓CD3 4+ 细胞凋亡状况 ,探讨CAA可能的发病机制。方法　采用单克隆抗体 -免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化 39例CAA患者的骨髓CD3 4+ 细胞 ,用DNA末端原位标 (TUNEL)技术分析骨髓CD3 4+ 细胞原位凋亡状况。结果　CAA患者骨髓细胞的凋亡率为 (39.2 4± 12 .70 ) % ,健康对照组为 (8.5 0± 2 .30 ) % ,组间比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。凋亡细胞可见核染色质皱缩、凝聚 ,但未见到核碎裂现象及典型的凋亡小体。结论　CAA患者骨髓CD3 4+ 细胞的过度凋亡是其质或 /和量缺陷的原因之一     

愈障汤对慢性再生障碍性贫血患者骨髓CD34^＋细胞bcl—2表达的影响

目的探讨愈障汤治疗慢性再生障碍性盆血(CAA)的作用机制.方法对愈障汤治疗的39例CAA患者分别于治疗前后采用磁式细胞分选器(MACS)分离纯化骨髓CD34+细胞;采用SABC亲和细胞法和CMIAS系列多功能真彩图像分析仪检测骨髓CD34+细胞bcl-2的表达,并与26例健康对照组比较.结果CAA患者骨髓CD34+细胞bcl-2蛋白表达的阳性率和OD值治疗前均较健康组减低(P＜0.01),治疗后显著升高(P＜0.01),bcl-2蛋白表达与临床疗效呈正相关.结论愈障汤治疗CAA的作用机制可能是通过上调凋亡抑制基因bcl-2的表达,从而阻抑了骨髓CD34+细胞的过度凋亡.     

中西医结合治疗对慢性再生障碍性贫血患者骨髓CD_(34)~+细胞凋亡的影响

目的　探讨中西医结合治疗慢性再生障碍性贫血 (CAA)的临床疗效及作用机理。方法将 79例CAA患者随机分为治疗组 (40例 )和对照组 (39例 )。对照组单用西药治疗 ,治疗组用补肾活血通络方加西药治疗。并分别于治疗前后采用免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化骨髓CD3 4 + 细胞 ;用DNA末端原位标记 (TUNEL)技术分析骨髓CD3 4 + 细胞原位凋亡状况。结果　治疗组与对照组的基本治愈率、缓解率、总有效率分别为 37.50 %、2 5 .0 0 %、87.50 %和 2 0 .51 %、1 7.95 %、61 .54 %。 2组疗效比较有非常显著性差异 (P <0 .0 1 )。治疗前 2组骨髓CD3 4+ 细胞的凋亡率较健康组明显增高 (P <0 .0 1 ) ,治疗后治疗组骨髓CD3 4+ 细胞的凋亡率较治疗前明显降低 (P <0 .0 1 ) ,与对照组比较有非常显著性差异(P <0 .0 1 )。结论　中西医结合治疗CAA疗效高、毒副作用小。其作用机制可能是通过阻抑CAA患者造血细胞的过度凋亡 ,使骨髓造血功能重建     

慢性再生障碍性贫血患者血浆可溶性Fas,FasL水平与细胞凋亡的相关性研究

目的　研究慢性再生障碍性贫血 (CAA)血浆可溶性Fas ,FasL(sFas ,sFasL)水平与细胞凋亡的相关性 ,探讨CAA的发病机制。方法　随机选择经确诊的CAA患者 39例 ,采用酶联免疫吸附双抗体夹心 (ELISA)法检测细胞凋亡及sFas ,sFasL水平。结果　CAA患者血浆sFas水平明显低于对照组 (P <0 .0 1) ,而细胞凋亡指数明显高于对照组 (P <0 .0 1)。二者变化水平呈负相关。血浆sFasL水平与对照组比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　CAA患者血浆sFas水平显著降低可导致造血细胞的过度凋亡 ;CAA发病过程中不但存在凋亡因素的增多 ,而且存在抗凋亡因素的减少     

应用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统分离纯化再生障碍性贫血骨髓CD34^＋细胞

目的 分离、纯化再生障碍性贫血(简称AA)患者骨髓CD34^ 细胞，探讨其发病机制。方法 对42例AA患者，以常规方法进行骨髓液采集和有核细胞分离，用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统(MACS)分离、纯化骨髓CD34^ 细胞，用碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶(APAAP)法作CD34^ 细胞的纯度检测。结果 骨髓CD34^ 细胞纯度达95％—99％，AA患者骨髓CD34^ 细胞多呈单个、散在分布，着色较淡；而对照组骨髓CD34^ 细胞多呈均匀或丛簇状分布，着色较深。结论 应用MACS分离从骨髓CD34^ 细胞，特异性强、纯度高，是研究从骨髓CD34^ 细胞功能、形态的最直接、客观、准确的方法。     

细胞凋亡与再生障碍性贫血

细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)和细胞增殖、分化一起维持着多细胞机体的平衡。造血干细胞缺乏导致造血功能衰竭一直被认为是再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)的主要发病机制。最近发现AA患者骨髓中CD34^ 细胞凋亡增强是其数量缺乏原因之一，并证实Fas／FasL系统参与了诱导AA患者骨髓中CD34^ 细胞凋亡。     

再生障碍性贫血患者骨髓CD34~+和Fas~+细胞Fas抗原的表达

采用流式细胞术检测再生障碍性贫血 (AA ,以下简称再障 )患者骨髓CD34 + 细胞表面Fas抗原的表达 ,采用体外短期液体培养的方法研究干扰素γ(IFN γ)对AA患者骨髓CD34 + 细胞表面Fas抗原表达的影响 ,以探讨Fas介导的凋亡在AA发病中的作用。正常对照骨髓CD34 + 细胞表面Fas抗原的表达率为 ( 1 0 .0 2± 2 .33) % ,重型再障组(SAA)和慢性再障组 (CAA)分别为 ( 38.2 8± 9.0 1 ) %和 ( 2 6 .6 6± 4 .2 7) % ,SAA组和CAA组与对照组比较均有显著性差异 (P <0 .0 1 ,P <0 .0 5 ) ;SAA组与CAA组比较也有显著性差异 (P <0 .0 5 )。正常骨髓单个核细胞在含SCF、IL 3、GM SCF和EPO细胞因子组合的液体培养体系中培养 ,加入IFN γ时 ,CD34 + 细胞表面Fas抗原表达稍增高 ,AA患者骨髓在上述相同的条件下 ,CD34 + 细胞表面Fas抗原表达与正常对照骨髓比较显著增高 (P <0 .0 5 ) ,且SAA组明显高于CAA组 (P <0 .0 5 )。实验结果表明 ,AA患者骨髓CD34 + 细胞表面Fas的表达明显高于正常对照 ;AA患者骨髓单个核细胞体外培养时 ,IFN γ促使骨髓CD34 + 细胞表面Fas的表达作用较正常对照明显增强。结果提示 ,AA患者骨髓CD34 + 细胞表面Fas的异常表达可能与AA的发病有关。     

原位DNA末端转移酶法检测细胞凋亡的影响因素

利用原位ＤＮＡ末端转移酶（ＩＳＴｄＴ）法检测肝硬变、肝癌组织标本及小鼠小肠粘膜上皮细胞凋亡。结果发现２５ｍｇ·Ｌ＾－１蛋白酶Ｋ消化１５ｍｉｎ，ＴｄＴ反应后采用中火档微波处理５ｍｉｎ可获最佳结果。对上述条件的最佳选择进行了探讨。     

再生障碍性贫血患者血清诱导淋巴细胞凋亡

目的 :探讨再生障碍性贫血 (再障 )患者淋巴细胞凋亡增加的机制。方法 :用免疫荧光染色检测重型再障患者血清对正常人淋巴细胞凋亡的促进作用及PML表达的诱导作用。结果 :10例重型再障患者血清作用后的淋巴细胞的凋亡率较正常人血清作用后明显增加 (P <0 .0 5 )。同时 ,PML蛋白也明显高表达 (P <0 .0 0 1) ,两者呈正相关 (r =0 919,P <0 .0 0 1)。结论 :重型再障患者血清可诱导淋巴细胞PML蛋白的高表达 ,从而导致淋巴细胞凋亡。     

再生障碍性贫血血清抑制物诱导脐血造血细胞凋亡

目的 :研究再生障碍性贫血血清抑制物诱导人脐血造血细胞凋亡的作用。方法 :提纯的再障血清抑制物加到人脐血造血细胞培养体系中 ,采用形态学观察及 TUNNL 法测定细胞凋亡。结果 :2 0例脐血造血细胞分别与 0 .1μg/m l,1μg/m l,10 μg/m l的再障血清抑制蛋白组份共同培养后 ,凋亡细胞发现率分别为 3.5± 1.6 % (P>0 .0 5 ) ,41± 9.8 (P<0 .0 1) ,6 0 .3± 18.2 (P<0 .0 1) ,而对照组为 2 .6± 1.5 %。结论 :再障血清抑制蛋白组分量与脐血造血凋亡细胞数量呈正相关。证明再障血清抑制蛋白组份与造成血细胞凋亡有一定的量效关系 ,推测造血细胞凋亡增加可能是再障发病的主要机制     

补肾活血方药对慢性再生障碍性贫血患者骨髓细胞体外影响的实验研究

目的　研究补肾活血方药对慢性再生障碍性贫血 (CAA)患者骨髓细胞体外增殖的影响 ,探讨其治疗CAA的机制。方法　采用细胞培养 ,光镜下观察补肾活血中药作用于CAA患者骨髓细胞后的形态学 ;3 H TdR掺入和液体闪烁技术方法 ,检测补肾活血中药对CAA患者骨髓细胞的增殖变化。结果　加入补肾活血中药组 ,CAA患者骨髓细胞培养第 4 8小时见细胞丛明显增多 ,72h见大量集落形成 ;3 H TdR掺入法显示 ,补肾活血中药组骨髓细胞的增殖 ,以每孔 75g L最有效。在 5 0～ 10 0g L范围内 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 1) ;2 5g L和 12 5g L组与对照组比较差异无显著性 (P <0 .0 5 )。结论　补肾活血方药在体外有促进CAA患者骨髓细胞增殖的作用 ,为补肾活血中药治疗CAA提供了实验与理论依据     

愈障汤对慢性再生障碍性贫血患者骨髓CD_(34)~+细胞bcl-2表达的影响

目的　探讨愈障汤治疗慢性再生障碍性盆血 (CAA)的作用机制。方法　对愈障汤治疗的 39例CAA患者分别于治疗前后采用磁式细胞分选器 (MACS)分离纯化骨髓CD3 4+ 细胞 ;采用SABC亲和细胞法和CMIAS系列多功能真彩图像分析仪检测骨髓CD3 4+ 细胞bcl 2的表达 ,并与 2 6例健康对照组比较。结果　CAA患者骨髓CD3 4+ 细胞bcl 2蛋白表达的阳性率和OD值治疗前均较健康组减低 (P <0 .0 1) ,治疗后显著升高 (P <0 .0 1) ,bcl 2蛋白表达与临床疗效呈正相关。结论　愈障汤治疗CAA的作用机制可能是通过上调凋亡抑制基因bcl 2的表达 ,从而阻抑了骨髓CD3 4+ 细胞的过度凋亡。     

应用单克隆抗体-免疫磁珠分离系统分离纯化再生障碍性贫血骨髓CD_(34)~+细胞

目的　分离、纯化再生障碍性贫血 (简称AA)患者骨髓CD3 4+ 细胞 ,探讨其发病机制。方法　对4 2例AA患者 ,以常规方法进行骨髓液采集和有核细胞分离 ,用单克隆抗体 免疫磁珠分离系统 (MACS)分离、纯化骨髓CD3 4+ 细胞 ,用碱性磷酸酶 抗碱性磷酸酶 (APAAP)法作CD3 4+ 细胞的纯度检测。结果　骨髓CD3 4+ 细胞纯度达 95 %～ 99% ,AA患者骨髓CD3 4+ 细胞多呈单个、散在分布 ,着色较淡 ;而对照组骨髓CD3 4+ 细胞多呈均匀或丛簇状分布 ,着色较深。结论　应用MACS分离AA骨髓CD3 4+ 细胞 ,特异性强、纯度高 ,是研究AA骨髓CD3 4+ 细胞功能、形态的最直接、客观、准确的方法     

再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞中细胞周期蛋白D的表达及意义

目的 观察再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞中细胞周期蛋白D(CyclinD)不同亚型的表达，以探讨其发病机制。方法 抽取再生障碍性贫血患者及正常对照组骨髓标本，用淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞，按Trizol-氯仿-异丙醇一步法提取细胞总RNA，用RT-PCR方法检测Cyclin D不同亚型(D1、D2、D3)的表达。结果 Cyclin D1在两组标本中都没有表达，而Cyclin D2、Cyclin D3有表达，且再生障碍性贫血患者的表达率及表达水平都显著低于正常对照组。结论 再障患者骨髓单个核细胞中Cyclin D的表达显著降低可能是再障造血抑制、骨髓衰竭的原因之一。     

An Enzymologic Study on Bone Marrow Cells in Patients with Aplastic Anemia Treated by Supplementing the Kidney and Removing Blood Stasis

The content of cytochrome oxidase(CCO),succinate dehydrogenase(SDH)and neutrophil alkalinephosphatase(NAP)in bone marrow cells in 68 cases of aplastic anemia before and after treatment wasdetermined by computerized graphical analysis and compared with that of normal volunteers(controlgroup).The significantly lowered CCO and SDH levels and the markedly increased NAP contentbefore treatment(P<0.01)became approximately normal after that of supplementing the kidney andremoving blood stasis(P>0.05).