一种新型无细胞真皮基质的研制

目的：研制一种新型的无细胞真皮基质。方法：用高渗盐除去异体皮肤的表皮细胞，经戊二醛交联后以低浓度NaOH消蚀以除去真皮中的细胞成分，得到无细胞真皮基质。结果：皮肤中所有细胞成分都被消除，胶原纤维稍松散，结构完整，排列正常。结论：经高渗盐—NaOH消蚀法能完全去除皮肤中的细胞成分而不损伤胶原纤维的三维结构，制备过程简单，具有很大的临床应用价值。     

优选人脱细胞真皮基质及荧光标记示踪与其复合培养的成纤维细胞

目的 优选人脱细胞真皮基质(ADM)并评价其生物学特性. 方法 通过高渗盐-NaOH消蚀法(A组)、高渗盐-十二烷基硫酸钠(SDS)法(B组)和DispaseⅡ-Triton X-100法(C组)制作人脱细胞真皮基质,以特殊染色、免疫组织化学观察3种方法 制作ADM的组成成分;四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验评价3种方法 制作ADM的细胞毒性反应;细胞培养法评价其细胞相容性,优选ADM .重组腺病毒绿色荧光表达载体(Ad-GFP)转染的人成纤维细胞(FB)接种在优选ADM上,荧光显微镜观察 FB的生长情况. 结果 3种方法 均能够保留胶原纤维、弹性纤维, A组和C组能够完全脱去细胞,B组未能完全脱去细胞;A组和B组制备ADM细胞毒性反应小于1级;C组制备ADM细胞毒性反应大于1级.A组与B组24h 3T3细胞贴壁数有统计学意义( P <0.05),3T3细胞能够在A组ADM表面贴附;优选A组ADM.转染Ad-GFP的FB在优选ADM上生长和增殖良好. 结论 高渗盐-NaOH消蚀法制备的ADM蕴涵丰富的生物信息,细胞毒性小,生物相容性好,是一种很好的生物支架材料.     

NaOH消蚀法制备脱细胞真皮基质修补腹壁疝

背景：与其他疝修补材料相比,脱细胞真皮基质具有易血管化、抗感染、从而可用替代传统补片用于感染腹壁缺损重建等特点。 目的：观察NaOH消蚀法制备的脱细胞真皮基质作为修补材料应用于腹疝的应用价值。 方法：以全厚猪皮制成脱细胞真皮基质,45只SD雄性大鼠制备腹壁疝模型,随机数字表法分为腹壁疝组：直接缝合皮肤,Marlex网组和脱细胞真皮基质组：分别应用大小为3.5 cm×4.0 cm的Marlex网和脱细胞真皮基质缝合皮肤;观察修复后1周时有无腹壁疝发生,脱细胞真皮基质组修复后1,2,3,5,10周分别取材,其中每周各组取4只用于苏木精-伊红染色,光镜观察。修复后第5周Marlex网组和脱细胞真皮基质组各取6只用于抗张力试验。 结果与结论：术后1周脱细胞真皮基质组与Marlex网组腹壁疝发生率均显著低于腹壁疝组(P < 0.001)。脱细胞真皮基质的胶原纤维无明显变化,即有少量成纤维细胞植入,术后2周可见新生血管,术后5周脱细胞真皮基质内部血管密度基本稳定。将单独脱细胞真皮基质片与Marlex网行抗张力试验,Marlex网的抗张力显著高于脱细胞真皮基质(P < 0.001)。但植入体内5周后,脱细胞真皮基质筋膜组织的抗张力高于Marlex-筋膜组织(P < 0.05)。提示复合消蚀制备的脱细胞真皮基质可以作为良好的疝修补材料。     

脱细胞真皮基质修复组织缺损研究进展

脱细胞真皮基质(ADM)是一类经过特殊方法分离皮肤表皮与真皮,去除真皮层内的朗格汉斯细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等附件细胞以及抗原成公主要组织相容性复合物(MHC)而仅保留胶原纤维、弹力蛋白等细胞外基质的特殊生物材料.ADM不引起机体排斥反应,为组织修复提供了良好支架,便于血管化和宿主细胞植入.其制备过程包括分离表皮与真皮、脱细胞成分及打孔、冷冻干燥等.根据分类方法的不同,ADM可分为同种异体ADM和异种ADM、补片型及注射型ADM、交联型与非交联型ADM,同时已有产品相继问世,可根据临床需要进行选择.ADM现已广泛应用于各外科领域,如深度皮肤烧伤、乳腺癌术后乳腺重建、修复口腔黏膜、腹壁疝及声带麻痹等.因其自身特点,临床应用前景广阔.就ADM近年来的研究进展作一综述.     

异种羊脱细胞真皮基质与自体微粒皮复合移植后创面愈合及COX-2、VEGF的表达研究

目的 制备异种羊脱细胞真皮基质(ADM),观察异种羊ADM与自体微粒皮复合移植的组织学变化,以及免疫组化法检测环氧化酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)在复合移植过程中的表达.方法 用0.25%胰蛋白酶和0.5%曲拉通(Tritonx-100)溶液联合脱细胞法制备异种羊ADM.以48只wistar大鼠为动物模型随机分为2组,每组各24只,背部做4 cm×3 cm全层皮肤缺损,分组采用羊ADM+自体微粒皮+异体皮(实验组)及自体微粒皮+异体皮(对照组)覆盖,术后2、4、6周观察植皮区愈合情况,检测创面收缩率;同时,在以上不同时间段处死大鼠做组织病理学观察及免疫组化检查.结果 (1)通过实验可成功制备出合格的异种羊ADM,脱细胞异种皮的镜下观察可见基质中的表皮已经完全除去,胶原纤维粗细均匀,排列规则,没有细胞成份存在.(2)进行移植术后,观察6周,两组皮片创面基本愈合,两组创面收缩率差异具有统计学意义(P<0.05),实验组术区收缩程度低,组织学检查可见成纤维细胞和血管长人,胶原纤维、弹力纤维结构排列规则;对照组创面收缩明显,组织学检查见成纤维细胞和血管无规则生长,胶原纤维、弹力纤维结构排列紊乱.两组大鼠创面COX-2、VEGF表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 异种羊ADM在彻底脱除了基质中有免疫原性的细胞成分的同时,又保留了组织的基本结构,成为极低抗原性的真皮支架,是一种良好的真皮替代物;异种羊ADM与自体微粒皮复合移植后外观和功能优于自体微粒皮移植;COX-2,VEGF可能参与了创面的修复.     

异种羊脱细胞真皮基质与白体微粒皮复合移植后创面愈合及COX-2、VEGF的表达研究

目的制备异种羊脱细胞真皮基质（ADM）,观察异种羊ADM与白体微粒皮复合移植的组织学变化,以及免疫组化法检测环氧化酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）在复合移植过程中的表达。方法用0．25％胰蛋白酶和O．5％曲拉通（TritonX-100）溶液联合脱细胞法制备异种羊ADM。以48只Wistar大鼠为动物模型随机分为2组,每组各24只,背部做4cm×3cm全层皮肤缺损,分组采用羊ADM＋自体微粒皮＋异体皮（实验组）及自体微粒皮＋异体皮（对照组）覆盖,术后2、4、6周观察植皮区愈合情况,检测创面收缩率;同时,在以上不同时间段处死大鼠做组织病理学观察及免疫组化检查。结果（1）通过实验可成功制备出合格的异种羊ADM,脱细胞异种皮的镜下观察可见基质中的表皮已经完全除去,胶原纤维粗细均匀,排列规则,没有细胞成份存在。（2）进行移植术后,观察6周,两组皮片创面基本愈合,两组创面收缩率差异具有统计学意义（P〈0．05）,实验组术区收缩程度低,组织学检查可见成纤维细胞和血管长入,胶原纤维、弹力纤维结构排列规则;对照组创面收缩明显,组织学检查见成纤维细胞和血管无规则生长,胶原纤维、弹力纤维结构排列紊乱。两组大鼠创面COX-2、VEGF表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论异种羊ADM在彻底脱除了基质中有免疫原性的细胞成分的同时,义保留了组织的基本结构,成为极低抗原性的真皮支架,是一种良好的真皮替代物;异种羊ADM与自体微粒皮复合移植后外观和功能优于白体微粒皮移植;COX-2,VEGF可能参与了创面的修复。     

神经细胞外基质材料制备及修复周围神经缺损的实验研究

目的 :制备一种新型天然神经细胞外基质材料 ,通过动物实验研究 ,探讨其修复周围神经干节段性缺损的可行性。方法 :采用NaOH消蚀法 ,制备家兔坐骨神经细胞外基质材料 ,行扫描电镜观察及生物相容性实验 ,用于桥接修复家兔坐骨神经节段性缺损并以自体神经修复作为对照 ,术后通过肌电图检测、再生神经纤维组织学观察等方法 ,证实该支架可有效地引导和促进神经纤维再生。结果 :(1)经NaOH消蚀处理的坐骨神经组织 ,其细胞成分被完全消蚀掉 ,神经膜管保持原有的构筑特征 ;无明显排异反应并可降解吸收。 (2 )该材料和自体神经移植修复周围神经干节段性缺损在电生理和组织结构的恢复方面经统计学处理无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :此方法制备的细胞外基质材料可有效地桥接修复周围神经干节段性缺损 ,为其临床应用奠定实验基础。     

戊二醛交联优化脱细胞真皮基质的生物相容性

目的 通过体内包埋实验将优化的脱细胞真皮基质(ADM)与成纤维细胞(FB)体外培养,探讨是否具有生物相容性. 方法 用高渗盐-NaOH消蚀法制备得到大鼠ADM,用低浓度戊二醛交联ADM,未交联A组(0min)作为对照,根据交联时间不同分成B组(10min)、C组(15min)和D组(30min).通过大鼠体内包埋实验对比各组ADM 物理性状、包埋后面积、炎性反应、浸润生长的FB和毛细血管数目,选择出最佳交联时间.制备优化的人ADM,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测ADM的细胞毒性;人FB与ADM复合培养检测其细胞相容性,用免疫组织化学和透射电镜观察FB的生长和增殖情况;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FBⅠ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达. 结果 大鼠体内包埋实验显示,4周取材,未交联组不易触及移植物,植入物和周围的软组织基本融合难以分开;未交联组ADM的面积较包埋前缩小;未交联组ADM内有少量炎性细胞,胶原纤维嗜酸性弱;交联组ADM内未见炎性细胞,浸润生长的FB数目、血管数目与戊二醛交联时间的单因素相关性分析呈负相关;最佳的交联时间为10min.体外培养显示,优化ADM的细胞毒性反应0～1级;人FB能够很好地在优化的ADM表面贴附、生长和增殖;ADM内FBⅠ型、Ⅲ型前胶原mRNA的表达降低. 结论 高渗盐-NaOH消蚀法制备ADM,工艺简单、成本低、生物相容性好,可以提供细胞生长的空间,并可在细胞间转导通讯和信号,下调细胞外基质代谢系统.     

组织工程微粒皮肤的构建及其性能研究

目的 探索利用人成纤维细胞和York猪脱细胞真皮基质(ADM)微粒复合构建组织工程微粒皮肤的可行性并对其进行初步研究.方法 体外培养取自胎背的人成纤维细胞,用PKH26标记,将细胞与ADM微粒复合构建微粒皮肤,用荧光显微镜观察、电镜观察和MTT法检测组织工程微粒皮肤的性能.结果 脱细胞真皮基质微粒均匀柔软,弹性、韧性好,三维结构完整且排列规则.细胞与ADM微粒的复合情况良好,2 h后开始黏附,2d后增殖明显,10d增殖达到高峰;7 d时取材,HE和SEM显示成纤维细胞在ADM微粒表面成层黏附,并分泌大量基质;细胞生长良好.结论 利用人成纤维细胞和York猪的ADM微粒可以构建具有活性的组织工程微粒皮肤.     

不同方法制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架的组织结构

背景：理想的脱细胞方法要求既能完全去除供体细胞,降低免疫原性,又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分,以保持足够的机械强度。 目的：采用不同洗剂制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,对比其组织结构,探讨最为有效的脱细胞瓣膜支架制备方法。 方法：20个新鲜猪主动脉瓣膜随机分为新鲜对照组、去污剂组、酶消化组和去污剂-酶消化组,后3组分别使用Triton X-100、胰蛋白酶以及二者联合的方法制备脱细胞瓣膜支架,对比支架大体形态、苏木精-伊红染色、Mallory-Heidenhain染色和电镜下超微结构的不同。 结果与结论：经脱细胞处理后,去污剂组瓣叶柔软、光滑,苏木精-伊红染色少量核物质存留、纤维排列规整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维相交错,电镜下呈波浪状排列、原纤维横纹清楚;酶消化组瓣叶局部塌陷,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维排列较紊乱,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,电镜下纤维部分断裂、原纤维横纹存在;去污剂-酶消化组瓣叶柔软、光滑,苏木精伊红染色细胞完全去除、纤维完整,Mallory-Heidenhain染色胶原纤维和弹性纤维平行排列,电镜下纤维完好,但排列稀疏,原纤维横纹清晰。说明3种方法均可有效去除供体细胞,保持纤维结构相对完整,在完全清除供体细胞并保持纤维支架完整性方面,Triton X-100联合胰蛋白酶的方法更为有效。     

Process development of an acellular dermal matrix (ADM) for biomedical applications

The object of this study was to compare the extent of decellularization at each critical step of processing porcine skin to produce an acellular dermal matrix (ADM) for biomedical applications. The results demonstrated that the removal of epidermis using treatment with 0.25% trypsin for 18 h and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) for 12 h at room temperature was beneficial for the subsequent treatment to remove cells in the dermal structure. Lengthy incubation in 0.25% trypsin (12 h) and then 560 units/l Dispase (12 h) at 25 degrees C of small pieces of porcine skin from which the epidermis had been removed efficiently removed cells and cellular components from the skin. Histological examinations revealed that the epidermis, dermal fibroblasts, and epidermal appendages were completely removed by these treatments, and the basic dermal architecture of collagen bundles was that of a loose meshwork. Examinations by TEM showed that the characteristics of collagen fibers in the ADM were retained after complete removal of cells present under optimal conditions defined in this study. SDS-PAGE and size-exclusion HPLC revealed that collagen fibers in the ADM were mostly type I and showed two typical component peaks identified as oligomers and monomers, respectively.     

Action of testicular hyaluronidase on macromolecules of the cutaneous extracellular matrix. Study by computerized image analysis

The aim of this work was to precise the action of testicular hyaluronidase (Thiomucase, Millot Solac, Sanofi, France) on the extracellular matrix macromolecules of the skin in an experimental animal model. Intradermal injection of hyaluronidase in the rabbit acts on proteoglycans which are degraded. Collagen bundles are dissociated. This is due to endoglycosaminidase activity of the hyaluronidase on dermal proteoglycans. The network of the elastic fibers was not altered by the enzyme injections, this suggest the absence of elastolytic activity in the Thiomucase preparations. The dissociation of collagen bundles and the degradation of proteoglycans are followed by the resynthesis of the initially degraded proteoglycans. The observed morphological changes which follow the intradermal injection of hyaluronidase, confirm the ability of this enzyme to influence the composition and the structure of the dermis.     

Corneal reinforcement using an acellular dermal matrix for an analysis of biocompatibility, mechanical properties, and transparency

The aim of this study was to analyze the viability of using an acellular dermal matrix (ADM) as a reinforcement material for peripheral corneal thinning disease. The complete removal of cell components was confirmed by hematoxylin and eosin (H&E) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. Transmission electron microscopy determined that the stromal structure was well preserved. Uniaxial tests revealed that the ADM had strong mechanical properties. After being implanted into rabbit cornea the ADM showed no sign of rejection and even achieved good transparency 24weeks post-surgery. H&E staining demonstrated that keratocytes grew in the ADM and the ADM-cornea interface became blurry. Picrosirius red staining revealed great changes of collagen in the ADM. Uniaxial testing of the reinforced cornea showed better mechanical strength than the normal rabbit cornea, but this did not exhibit statistical significance. These results suggest that ADM is a worthy candidate for future exploration as a reinforcement material for peripheral corneal thinning problems.     

异体脱细胞真皮基质对大鼠皮肤瘢痕形成的影响

目的了解异体脱细胞真皮基质（accelular dermal matrix,ADM）对SD大鼠皮肤切口愈合后瘢痕形成的影响。方法4％NaOH溶液消蚀脱细胞法制备ADM,选用SD大鼠56只,每只大鼠背部脊柱两侧共做两道平行切口,建立皮肤切口模型。按自身对照分为实验组及对照组,实验组：将修剪成的ADM（3cm×0.3cm×0．1cm）植入切口,丝线缝合切口;对照组则原位缝合。术后3天、5天、7天、14天、21天、28天、63天（每个时相点8只）处死大鼠,取切口皮肤组织做HE、Masson染色,进行生物组织学检测,RT-PCR方法检测各组切口中成纤维细胞内Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平。结果术后实验组未见明显瘢痕组织,而对照组愈合后见明显线性瘢痕形成。镜下观察实验组切口中ADM逐渐被改建成自体组织,3天、5天、7天、14天及21天实验组中成纤维细胞数量较对照组减少（P〈0．05）;实验组切口中胶原的生成在各个时间点较对照组均减少,其中7天、14天、21天、28天及63天实验组切口中胶原的生成较对照组明显减少（P〈0．01）;RT-PCR检测组织中成纤维细胞内Ⅰ型前胶原mRNA相对表达量对照组（0．809±0．042）比实验组（0．540±0．026）增高。结论ADM能抑制切口中成纤维细胞的增生和胶原的过度分泌,减少瘢痕的形成。     

深度烧伤患者四肢关节功能部位的复合皮移植应用

 目的 观察异体无细胞真皮基质（ADM）在深度烧伤的四肢关节部位的临床移植效果。方法 以11例四肢关节部位深Ⅱ和Ⅲ度烧伤的患者为对象，采用复合皮（CS）移植技术将20块网状ADM（每块150～400 cm2）与自体超薄断层皮片（UTSG，厚度0.05 cm）重叠，组成CS，一次性移植于患者14处四肢关节区域的切痂或削痂创面上，并在邻近的烧伤部位移植自体断层中厚皮片（STSG，厚度0.15～0.20 cm）作为对照。术后10～14 d首次换药，定期随访和行移植皮片组织学观察。结果 术后2周CS成活率93.7%，STSG成活率为97.2%，二者比较差异无统计学意义（P>0.05）。随访1～3年，CS组未见明显的瘢痕增生和挛缩，所有患者关节屈伸范围正常。组织学观察显示，CS真皮层无皮肤附件，胶原纤维排列有序，仅有少量淋巴细胞浸润。但在烧伤后期感染创面上的CS移植效果（外观质地和组织结构）不及烧伤早期的清洁创面。结论 深度烧伤患者关节部位尽早应用ADM能够产生满意的整形效果并满足关节功能需要。     

Characterization and tissue incorporation of cross-linked human acellular dermal matrix

Here, we describe a novel human acellular dermal matrix (ADM) cross-linked using electron beam irradiation. Structural and biomechanical characteristics of the human ADM were assessed by infrared spectrometry and uni-axial tensile testing. Electron beam irradiation affects collagen secondary structure, which can be detected in the amide I spectral region (1660 cm⁻¹ and 1690 cm⁻¹). At doses exceeding 25 kGy, cross-linking of the collagen matrix results in a denser, more stratified appearance and parallel arrangement, with significantly increased tensile strength and elastic modulus. In a micropig model, the implanted ADM elicits rapid host cell infiltration and extracellular matrix deposition; however, the delayed remodeling resulted in long-term structural integrity. Furthermore, mean densities of collagen and elastin, expression of extracellular matrix proteins, and microvessel formation within the implanted ADM increased significantly, whereas the thickness of the implanted ADM did not decrease during the course of the study. Compared with normal adjacent tissue, type I collagen mRNA levels in the ADM increased 12-fold at 3 months after implantation, and transforming growth factor-β mRNA levels increased 3.3-fold at 2 months. Matrix metalloproteinase (MMP)-1 and MMP-9 mRNA levels were also elevated. Collectively, these results demonstrate that the structural and biomechanical properties of this novel cross-linked human ADM are adequate for use as a biologic tissue substitute.     

NaOH消蚀骨基质材料的研制及其修复骨缺损实验研究

目的:制备骨基质支架并与自体红骨髓联合移植修复兔桡骨节段性骨缺损,探讨该支架作为骨组织工程载体的可行性。方法:采用NaOH消蚀技术,制备出家兔骨细胞外基质支架,行扫描电镜观察及生物相容性实验,并与自体红骨髓联合移植于兔桡骨节段性骨缺损模型,通过X线、生物力学等检查,比较其联合红骨髓及单纯支架移植修复节段性骨缺损的疗效。结果:(1)经NaOH消蚀处理后,骨组织中的细胞成分被彻底清除,细胞外基质成分-胶原纤维仍维持三维立体网状结构;无明显排异反应且可降解吸收。(2)支架+自体红骨髓修复骨缺损,4周即出现成骨现象,8周可修复骨缺损;单纯支架移植,约在12周修复。生物力学测试结果,复合红骨髓组抗压强度大于对照组(P<0.05)。结论:此方法制备的骨基质材料与红骨髓联合,可有效地修复节段性骨缺损,是理想的骨组织工程天然载体。