云锡矿工肺癌组织cDNA文库的构建

肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,其死亡率占癌症死亡率的２５％［１］。电离辐射是诱发肺癌的主要物理因素之一。由氡及其短寿命子体所释放的α粒子诱发的肺癌占辐射诱发肺癌的５０％。氡及其短寿命子体所致肺癌首先在矿工中得以证实［２］。云南锡业公司矿工是国内矿工肺...     

云锡矿工肺癌病因学研究的概况

本文简要回顾了近３０年来云锡矿工肺癌病因学研究的概况，介绍了“氡砷复合，以氡为主”的病因学观点的现场研究与实验室研究的证据，提出矿工肺癌病因中氡／砷相对贡献的比值，提出利用该比值制定氡砷复合暴露时井下氡－砷空气浓度限值的办法及供肺癌矿工职业赔偿使用的计算病因概率的参数。作者认为由于存在一些技术上的问题，目前很难根据现有的流行病学研究资料计算云锡矿工的氡致肺癌危险系数。     

用差异显示法研究云锡矿工肺癌组织相关基因

目的为探讨矿工肺癌发生的机理,作者研究了与云锡矿工肺癌组织相关的基因。方法以云南锡矿工肺癌切除术的癌组织和正常肺组织为样品,用差异显示法比较两种组织差异表达基因,并将其克隆测序。结果在肺癌组织和同例正常肺组织中发现有３０个表达差异的基因片段。其中,１６个片段仅在肺癌组织中表达而不在正常组织中表达;１４个片段仅在正常组织中表达而不在肺癌组织中表达;测定了６个片段的序列。ＣＧ２、ＣＧ７、ＣＧ８、ＣＡ５和ＣＣ６５个序列在Ｇｅｎｂａｎｋ中未查到有７５％同源的序列,被认为是新序列并在Ｇｅｎｂａｎｋ中登录。ＣＧ３与人核糖体蛋白Ｌ２７ａ有９５％同源性。结论在矿工肺癌组织和同例正常肺组织中有已知和未知的表达差异基因存在。     

沙鼠耳蜗cDNA文库的构建

为了建立沙鼠耳蜗的cDNA文库 ,先提取沙鼠耳蜗的mRNA并经oligo(dT)引物合成cDNA第一链 ,经LD PCR法扩增合成双链cDNA后 ,克隆到λTriplex2中扩增文库。用耳蜗特异的prestin蛋白基因引物作PCR ,鉴定文库。结果显示 ,文库的库容量为 1.8× 10 6pfu ,重组率为 80 % ,用prestin蛋白基因引物可扩增出 86 3bp的prestin蛋白基因。研究表明 ,构建的文库具有较好的库容量及重组率 ,且插入片段很大 ,为从分子生物学方面研究耳蜗打下了基础     

人胎肝cDNA文库的构建

从水囊引产的4～5个月孕龄胎儿肝脏中提取mRNA,合成单、双链CDNA,用离心式柱层析去除短的cDNA片段,加上EcoRI接头,与去磷酸化的λgt 11 DNA-EcoRI长、短臂连接,体外包装后感染Y1090,建成含4.05×10~5重组子的表达型人胎肝cDNA文库。白斑噬菌体DNA经酶切鉴定表明均含1kb以上大小不等的CDNA片段。     

p53蛋白在云锡矿工肺癌中的表达

ｐ５３蛋白在云锡矿工肺癌中的表达秦全红王德文孙世荃杨绍和高亚兵云锡矿工肺癌的高发起因于既往井下氡子体和含砷矿尘的暴露［１］。Ｔａｌｏｒ等［２，３］对铀矿工肺癌研究，认为氡致肺癌与ｐ５３基因有关。为了探讨ｐ５３基因在云锡矿工肺癌病因中的作用，本文对云锡...     

云锡矿工肺癌发病的时相性规律和群体预测模型

利用云锡公司最大矿山老厂矿退休工人档案建立矿工肺癌流行病学研究的回顾前瞻队列(1960～1984),证明矿工肺癌发生率像一般居民肺癌一样随年龄而增加,符合相对危险模型.根据不同人群肺癌相对危险水平(SMR)和寿命表对肺癌死亡人数进行预测,结果预测值与实际发生人数间的误差不超过10～20%.该预测系统的优点是不需要提供既往剂星资料,例如WLM,其局限性是它祗能应用于具有相同暴露条件的人群.     

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因     

吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库的构建

目的:构建吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库.方法:建立大鼠吗啡躯体依赖模型后,取鼠脑进行总RNA的抽提、mRNA的纯化,以mRNA为模板合成第一链cDNA后用LD-PCR方法合成双链cDNA,用限制性内切酶SfiⅠA、B分别双酶切双链cDNA与pTRG载体,连接后的cDNA文库转化XL1-Blue MRF′ Kan 超级感受态并收菌,完成cDNA文库构建.结果与结论:PCR结果显示,cDNA片段连接效率＞90%,cDNA插入片段在1 kb左右.吗啡依赖大鼠脑cDNA文库总容量为3.05×106,满足下一步细菌双杂交文库筛选要求.     

斜带石斑白细胞cDNA文库的构建

用Tripure试剂盒提取斜带石斑白细胞总RNA ,反转录合成第一链cDNA ,进行长距离PCR ,蛋白酶K消化 ,SfiI酶切 ,通过CHROMASPIN - 40 0柱 ,回收大于 5 0 0bp的cDNA ,与λTripIEx2载体连接 ,体外包装后构建了斜带石斑细胞的cDNA文库。库容 1 .6 5× 1 0 6 ,重组频率 82 % ,扩增后滴度 7.5× 1 0 9pfuml- 1。插入片断长度 5 0 0～ 2 30 0bp ,最多的是在 75 0～ 1 0 0 0bp范围。本文库可作为筛选斜带石斑细胞因子基因的重要资源     

快速老化小鼠海马抑制消减cDNA文库的构建

目的：构建快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)海马抑制消减cDNA文库。方法：以SAM快速老化亚系SAM-prone/8(SAMP8)海马作为实验组，抗快速老化小鼠亚系SAM—resistance/1(SAMR1)海马作为对照组，应用抑制消减杂交(SSH)技术，构建海马特异表达cDNA抑制消减文库；用蓝白斑筛选，以鉴定文库质量。结果：构建文库的阳性克隆率为96.18％，克隆中cDNA片段介于250-2000bp之间。结论：成功构建了SAMP8海马抑制消减文库。     

对Hazelton等提出的云锡矿工肺癌主要危险来自砷的商榷

Using two-stage clonal expansion model with data-base provided by Lubin, WD Hazehon et al indicated the high risk of arsenic, but not radon, in the etiology of Yunnan tin miner' s lung cancer. The author of this review iterated the problems in the data-base of Lubin,and considered that it may result in low estimate for the risk of radon in paper of Hazehon et al. Attributable risk was estimated by them with changing exposure patterns of each individual, but the efficacy of this two-stage model will be violated by the invariability of appointed radon/arsenic exposures. Risk comparison was used to distinguish the contribution from radon/arsenic, which was hampered by the high correlation between their joint exposures. As Lubin, Hazehon et al neglected the confounding from environmental arsenic pollution in early years. From all of above, their viewpoint is worth to be deliberated.     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

Objective To screen and isolate the radioresistance related genes of IRM-2 mice.Methods cDNA library of IRM-2 mice was constructed by SMART technique.Total RNA was isolated from spleens of IRM-2 male mice.The first-strand cDNA was synthesized by using PowerScript reverse transeriptase,and double-strand cDNA was synthesized and amplified by long PCR.The PCR products were purified,digested with restriction enzyme Sfi I.The ds-cDNA fragment lessthan 500 bp was fractionated and ligated to the Sfi I-digested pDNR-LIB vector.The ligation mixture was transformed into E.coil DH5α by electroporution transformation to generate the unamplified cDNA library.The quality of cDNA library was identified by PCR technique.130 clones from cDNA library were sequenced and compared with GenBank database.Results The cDNA library contained 2.25 x 106 independent clones with an average insert size of 1.2 kb.The ratio of recombination and full-length was 95% and 55%,respectively.21 pieces of EST sequences from cDNA library were not the same as the known mice genes and registered into GenBank EST database,with registered number DW474856-DW474876.Conclusions cDNA library of IRM-2 mice has been constructed successfully.21 pieces of EST implies that radioresistance correlative genes may be in IRM-2 mice,which will lay a foundation for isolating and identifying radioresistance related genes in further study.     

大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选

目的构建脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库,探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子。方法用LPS(10mg/ml)和Dex(10-5mol/L)作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后,从肺泡巨噬细胞中提取总RNA,再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的双链cDNA,后者纯化后,与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆,即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌,筛选与GR相互作用的蛋白分子。结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMscDNA文库,共获得1.07×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3~1.5kb之间。筛选文库获得1个真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1。结论利用ClontechSMART技术成功构建了肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库;GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用。     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

Objective To screen and isolate the radioresistance related genes of IRM-2 mice.Methods cDNA library of IRM-2 mice was constructed by SMART technique.Total RNA was isolated from spleens of IRM-2 male mice.The first-strand cDNA was synthesized by using PowerScript reverse transeriptase,and double-strand cDNA was synthesized and amplified by long PCR.The PCR products were purified,digested with restriction enzyme Sfi I.The ds-cDNA fragment lessthan 500 bp was fractionated and ligated to the Sfi I-digested pDNR-LIB vector.The ligation mixture was transformed into E.coil DH5α by electroporution transformation to generate the unamplified cDNA library.The quality of cDNA library was identified by PCR technique.130 clones from cDNA library were sequenced and compared with GenBank database.Results The cDNA library contained 2.25 x 106 independent clones with an average insert size of 1.2 kb.The ratio of recombination and full-length was 95% and 55%,respectively.21 pieces of EST sequences from cDNA library were not the same as the known mice genes and registered into GenBank EST database,with registered number DW474856-DW474876.Conclusions cDNA library of IRM-2 mice has been constructed successfully.21 pieces of EST implies that radioresistance correlative genes may be in IRM-2 mice,which will lay a foundation for isolating and identifying radioresistance related genes in further study.     

IRM-2小鼠全长cDNA文库的构建及鉴定

目的 分离和鉴定IRM-2小鼠辐射抗性相关基因。方法 采用SMART技术构建IRM-2小鼠全长cDNA文库,提取雄性IRM-2小鼠脾脏总RNA,以此为模板,通过逆转录酶PowerScript反转录合成第1链cDNA,通过长距离PCR合成并扩增双链 cDNA。该扩增产物经纯化、Sfi Ⅰ酶切、去除小于500 bp片段后,将cDNA连接到Sfi Ⅰ消化过的PDNR-LIB质粒载体中,用电转化法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α,得到IRM-2小鼠cDNA原始文库并用PCR法对文库的质量进行鉴定。随机从cDNA文库挑选130个阳性克隆进行测序,与GenBank基因库进行同源性比较。结果 构建的cDNA文库的容量为2.25×10⁶个克隆,重组率达95%,平均插入片段长度约1.2 kb,全长基因比例为55%。从cDNA文库挑选的阳性克隆中有21条EST序列与小鼠已知基因不同源,在GenBank的EST数据库的注册号为DW474856~DW474876。结论 成功构建了IRM-2小鼠全长cDNA文库,21条EST提示IRM-2小鼠体内可能存在辐射抗性相关基因,为进一步分离和鉴定辐射抗性相关基因奠定了基础。     

人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的 :构建人胃癌抑制消减cDNA文库 ,为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法 :从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A) +RNA ,经反转录后 ,利用抑制消减杂交(SSH)方法 ,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论 :挑取 80 0个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段 ,结果显示其中 750个克隆有插入片段 ,片段大小范围为 2 50～ 70 0bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。