人IL-18结合蛋白AcDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人IL－18结合蛋白（hIL-18BPa)的cDNA，观察其在COS－7的表达。方法：采用RT－PCR自人白血病细胞株jukat中获得hIL-18 BPa的cDNA，将其克隆至T－vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中，脂质体介导法将其转染COS－7细胞，72h后收集上清纯化，用BCA法测定hIL-18 BPa的含量，用ELISA法测定其活性。结论：获得的IL－18BPa的cDNA序列gene bank登录的cDNA序列一致。上清液中hIL-18BPa含量为1．4mg/L，并具有良好的生物学活性。结论：成功克隆hIL-18 BPa基因，并实现了COS－7细胞中的瞬时表达，为研究其活性奠定了基础。     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

酸敏感离子通道基因重组质粒的构建、表达及其活性测定

为了构建含有小鼠酸敏感离子通道(ASIC1a、ASIC2a)基因全长cDNA的重组质粒,并表达有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白,本研究通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别获得小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA,并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,构建含小鼠全长ASIC1a和ASIC2a基因的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,经DNA测序鉴定序列正确。脂质体法分别将其转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO),荧光显微镜下观察小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在细胞内的表达分布,Westernblot检测其蛋白表达。酸性处理转染重组质粒细胞,并比较其细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)的释放来评价融合蛋白的生物学活性。结果显示:本研究成功地分别将小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA克隆入pEGFP-N3载体中,并将其转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察到CHO细胞膜周围呈强绿色荧光条带,Westernblot显示小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白分别在90kD和88kD处有表达。经酸性处理的转染ASIC1a和ASIC2a重组质粒的CHO细胞,分别较其在pH7.4条件下的细胞存活率明显降低,LDH释放量明显增高,且通道阻断剂可抑制该效应。上述结果提示,我们已成功构建出含小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,并使有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在CHO细胞中表达。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

鼠IFN-λ2 CHO细胞系建立及生物学活性的研究

目的 稳定表达鼠IFN-λ2并对其生物学活性进行研究.方法 用水疱口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)刺激小鼠脾脏细胞,克隆mIFN-λ2全长基因,构建真核表达载体PCAGG-EGFP-mIFN-λ2,并在CHO细胞稳定表达,且在小鼠黑色素瘤B16细胞上进行抗病毒活性测定;构建MDBK-Mxp-Luc细胞系诱导Mx1抗病毒蛋白产生.结果 pMD18-T-mIFN-λ2双酶切鉴定,出现582 bp大小的条带,成功构建了PCAGG-EGFP-mIFN-λ2真核表达载体;稳定表达mIFN-λ2 CHO的细胞株分泌的上清中mIFN-λ2蛋白在B16细胞上的抗病毒活性为10~4 AU/ml;mIFN-λ2蛋白诱导鼠Mx1抗病毒蛋白的表达,9～12 h达高峰,24 h后消失(P<0.05).结论 建立了稳定表达mIFN-λ2的CHO细胞株,其分泌型mIFN-λ2蛋白具有明显的抗病毒活性,且与诱导Mx1抗病毒蛋白密切相关.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌HpureB基因,并构建其核酸疫苗。方法:以HpNCTC11637株基因组DNA为模板,用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中。将目的基因经SalI、BglⅡ酶切纯化后插入pTCAE中,转化E.coliDH5α。经SalI、XhoI酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB。以电穿孔法将pT-ureB转染CHO细胞,用Wes-tern blot检测UreB蛋白的表达。结果:克隆重组后得到pT-ureB。将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后,取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量(Mr)为62000处出现特异性条带。结论:成功地构建了HpureB核酸疫苗。体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础。     

小鼠趋化因子CCL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列,经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3.1-mCCL19Ig,酶切和测序鉴定插入序列;将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达,通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达,利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgG1 Fc段序列,其序列分别与GenBank中公布序列比对一致,IgG1 Fc段读码框未发生改变;Western blot结果证实转染了pcDNA3.1-mCCL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38 000的融合蛋白mCCL19Ig表达;体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性,且呈剂量依耐关系。     

人胰岛素样生长因子-1的真核表达及其生物学功能研究

目的：构建人胰岛素样生长因子1（IGF-1）分泌型真核表达载体，并检测表达产物的生物活性。 方法：用RT-PCR法从人肝细胞克隆IGF-1基因，并将其连入Psec Tag/FRT/V5-His载体，用脂质体法转染CHO细胞，将转染细胞上清培养骨髓基质干细胞，用MTT法测定骨髓基质干细胞的增殖情况。 结果：成功扩增210 bp的IGF-1基因，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blotting检测具有7.7 kD特异性条带。骨髓基质干细胞的增殖随转染细胞上清的浓度、转染细胞上清培养时间的增加而增加。 结论：成功构建分泌型IGF-1真核表达载体，其表达产物对骨髓基质干细胞具有促增殖作用。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。