肌细胞增强因子2A基因真核表达质粒的构建及对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响

目的：构建肌细胞增强因子2A（MEF2A）基因真核表达重组质粒,并转染乳腺癌细胞株观察其对细胞增殖能力的影响。方法：实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）检测MCF-7、BT474及MDA-MB-231等3种乳腺癌细胞中MEF2A mRNA的表达。采用全基因合成法合成MEF2A编码区序列,克隆入pcDNA3.1（＋）-HA载体,构建重组质粒pcDNA3.1-MEF2A-HA。重组质粒转染乳腺癌细胞,采用Western blot及RT-QPCR检测MEF2A的表达效率。细胞计数实验检测细胞的增殖能力。结果：3株乳腺癌细胞中,MDA-MB-231细胞中MEF2A mRNA表达水平较低;其基因测序结果显示与预期片段大小一致,表明MEF2A重组质粒构建成功。将MEF2A重组质粒瞬时转染MDA-MB-231细胞后,MEF2A表达质粒组与对照组比较,其MEF2A表达升高,细胞增殖能力增强。结论：成功构建MEF2A过表达重组质粒,在MDA-MB-231中过表达MEF2A促进细胞的增殖能力。     

人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

转染BRMS1基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭力的影响

目的:探讨BRMS1基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭力的影响.方法:将携带BRMS1基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc-BRMS1通过脂质体介导稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞;RT-PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;扫描电镜观察细胞表面超微结构的改变;Boyden小室检测细胞体外侵袭力.结果:转染成功的乳腺癌MDA-MB-231细胞其BRMS1mRNA呈高表达;细胞表面超微结构发生改变;体外侵袭力下降.结论:转染BRMS1基因可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外侵袭能力.     

pEGFP-N1/Arf6-T27N重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞株中的表达

目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础?方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞?用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变?结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N?以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移?结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移?     

全长及细胞内磷酸化位点缺失的人组织因子真核表达重组质粒的构建及其生物学功能

目的： 研究组织因子(tissue factor,TF)细胞内区域的功能,分析TF细胞内区域对人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响。方法： Trizol一步法抽提人乳腺癌细胞MDA-MB-231总RNA,RT-PCR扩增TF全长(TF full-length)基因和TF细胞内磷酸化位点缺失(TF truncated)基因,分别克隆入pGEM-T载体,再构建人TF full-length基因和TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated。将构建好的pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated瞬时转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达,并用发色底物法检测瞬时转染后TF的促凝血功能。利用Transwell小室检测转入人TF full-length基因和TF truncated基因后MCF-7细胞的迁移能力。结果： 扩增出人TF full-length基因和TF truncated基因,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),并且在MCF-7细胞中表达后具有促凝血活性。瞬时转染pcDNA3.1(+)-TF truncated不能增加MCF-7 细胞的迁移能力,而转染 pcDNA3.1(+)-TF full-length后可以显著增强MCF-7细胞的迁移能力。结论： 成功构建了带有人TF full-length,TF truncated基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-TF full-length和pcDNA3.1(+)-TF truncated,为研究TF以及其细胞内磷酸化位点区域在肿瘤学中的作用奠定了基础。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。     

RNAi沉默IBP基因表达对乳腺癌细胞的抑制作用

目的 构建IRF-4结合蛋白(IBP)基因RNA干扰 (RNAi) 的真核表达载体,观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞内IBP基因表达及细胞增殖和侵袭力的影响.方法 以IBP为靶基因,以pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR质粒为载体,设计构建4对重组体,并进行DNA测序鉴定.重组载体转染MDA-MB-231细胞后,选择转染效果最好的1对重组体建立稳定转染的细胞株,经RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对IBP mRNA和蛋白表达的抑制效果;MTT法检测对各组细胞生长的影响;细胞体外侵袭实验测定对侵袭力的影响.结果 重组体测序结果与目的序列完全一致;重组体转染MDA-MB-231细胞后IBP的mRNA和蛋白表达降低约70%;IBP表达下调后乳腺癌细胞增殖减缓(P<0.05);同时体外侵袭实验显示转染后乳腺癌发生迁移细胞数明显低于未转染组和空质粒对照组[分别为(25±7)、(67±6)、(68±5),P<0.05].结论 下调IBP能有效降低乳腺癌细胞的增殖和侵袭力.     

MIIP真核表达载体的构建及其稳定过表达MDA-MB-231细胞系的建立

目的构建pCDNA3.0-MIIP真核表达载体并建立其稳定转染的MDA-MB-231细胞系。方法pGEX-4T-1-MIIP重组质粒及pCDNA3.0真核表达载体分别经Xho I和EcoR I双酶切后,回收目的基因,T4 DNA连接酶连接后,转化得到pCDNA3.0-MIIP重组真核表达载体,对其进行双酶切和测序鉴定。脂质体法将鉴定后的pCDNA3.0-MIIP质粒转染至人乳腺癌MDA-MB-231细胞中,分别于转染后48和72h提取细胞总RNA,QRT-PCR法确定其转染。G418筛选转染细胞,Western blot检测目的蛋白表达。结果酶切及测序结果证实pc DNA3.0-MIIP真核表达载体构建成功。pcDNA3.0-MIIP转染至MDA-MB-231细胞后,QRT-PCR检测证实MIIP表达显著增强。G418筛选后得到单克隆细胞群,Western blot检测证实MIIP表达显著增强。结论成功构建出了可在真核细胞中高效表达MIIP基因的pc DNA3.0-MIIP重组质粒;建立了稳定过表达MIIP的MDA-MB-231细胞系。     

转染BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响

目的：探讨BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响。方法：将携带BRMS1基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc BRMS1通过脂质体介导稳定转染乳腺癌MDA MB 231细胞;RT PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;扫描电镜观察细胞表面超微结构的改变;Boyden小室检测细胞体外侵袭力。结果：转染成功的乳腺癌MDA MB 231细胞其BRMS1mRNA呈高表达;细胞表面超微结构发生改变;体外侵袭力下降。结论:转染BRMS1基因可抑制乳腺癌MDA MB 231细胞的体外侵袭能力。     

CCNL1真核表达载体的构建及其在MDA-MB-231细胞中表达的鉴定

目的:构建pcDNA3.1(+)-CCNL1、pVAX Ⅰ -CCNL1和pEGFP-C1-CCNL1三组重组载体,鉴定其在MDA-MB-231细胞中的表达情况.方法:用PCR方法扩增得到CCNL-1基因,然后用EcoR Ⅰ、HindⅢ酶切CCNL1基因,将其分别与pcDNA3.1(+)、pVAX Ⅰ和pEGFP-C1...     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

非分泌型CXCL16在乳腺癌细胞系中的表达及对其生物学特性的影响

目的 通过检测非分泌型CXCL16在不同侵袭性乳腺癌细胞系(SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S)及正常乳腺上皮细胞MCF-10A的表达,探讨非分泌型CXCL16表达对乳腺癌细胞生物学特性的影响。 方法 采用RT-PCR检测CXCL16 mRNA在MCF-10A、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S细胞系的表达,将pEGFP-CXCL16真核表达质粒转染到低表达CXCL16的MDA-MB-231细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blot验证CXCL16过表达,采用体外迁移、侵袭实验及甲基四唑蓝(MTT)法分别检测过表达CXCL16对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和增殖活性的影响。 结果 CXCL16 mRNA在高侵袭性的MDA-MB-231细胞低表达,在低侵袭性的MCF-7细胞高表达,过表达CXCL16使得MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭减弱,而增殖未受到影响。 结论 非分泌型CXCL16表达与乳腺癌细胞系的侵袭性相关,其表达可以抑制乳腺癌细胞的体外迁移、侵袭。     

沉默CC型趋化因子受体5对人乳腺癌细胞黏附及迁移的影响

构建CC型趋化因子受体5(CCR5)基因shRNA的真核表达载体,探讨沉默CCR5对乳腺癌细胞黏附与迁移能力的影响。在多种人乳腺癌细胞中检测CCR5的基因表达,选择CCR5表达较高的MDA-MB-231细胞做为基因沉默的研究对象;设计并合成2对靶向人CCR5基因的RNA沉默序列,连入基因沉默载体pSilencer 2.1-U6中,构建沉默质粒shCCR5-1 和shCCR5-2,定量PCR和蛋白印迹法检测CCR5基因沉默的效率;以细胞黏附实验和Transwell趋化小室实验分别检测沉默CCR5对MDA-MB-231细胞黏附和迁移能力的影响。结果表明,沉默CCR5可以抑制MDA-MB-231细胞的黏附能力,同时显著降低MDA-MB-231细胞的迁移和趋化。     

人乳腺癌细胞HYAL1基因真核表达载体的构建及其在MCF-7和ZR-75-30细胞中的表达

目的 构建人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体并稳定转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞株,为进一步探讨HYAL1基因在乳腺癌的侵袭和转移中的作用奠定基础.方法 采用RT-PCR技术从高表达HYAL1的人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S中扩增透明质酸酶HYLAL1基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建的重组表达质粒经脂质体介导转染HYAL1基因低表达的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞.结果 用RT-PCR成功地扩增出1条1 332 bp的DNA片段,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序证明已经成功构建了人乳腺癌HY-AL1基因的真核表达载体.RT-PCR证明转染了重组质粒的乳腺癌MCF-7和ZR-75-30细胞可以高效稳定的表达HYAL1基因,且其穿透细胞外基质的能力增强.结论 成功构建了人乳腺癌HYAL1基因的真核表达载体,获得了稳定表达人HYAL1基因的MCF-7和ZR-75-30细胞克隆,且其侵袭能力增强.     

人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定

目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体，转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231，观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA，所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组质粒poDNA3K5，脂质体法将其转染MDA—MB—231，G418筛选阳性克隆，PCR鉴定，RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞，MTT、法检测其增殖情况，并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确，将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确，并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后，其存活率降低；转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后，其分泌产生的有生物学活性的K5，呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用，而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。