p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的：研究外源P53反义RNA对有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法：构建反义P53cDNA真核细胞表达载体,PEGFP－P53（AS）,经酶切图证明反向联结质粒,Lipofectin介质转染有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801－D,经G418筛选获耐受克隆,稀释法建立单细胞克隆系,PCR检测外源基因,荧光显微镜检测细胞绿荧光蛋白表达,P53单抗免疫组化染色检测P53突变蛋白表达,体外集落形成,检测细胞恶性生长。流氏细胞仪检测细胞周期,MTTI地检测细胞对顺铂药物敏感性。结果：酶切图证明了P53－cDNA反向联结于质粒,构建了PEGFP－P53（AS）,建立了转染单细胞克隆系PEGFP－P53（AS）－801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源P53基因和neo基因存在于转染细胞PEGFP－P53（AS－801D。荧光显微镜下发现胞浆有绿荧光蛋白表达,免疫组化染色P53突变蛋白801D细胞系为阳性,而PEGFP－P53（AS）－801为阴性,证明外源反义P53封闭转染细胞内源突变蛋白表达。与母系相比PEGFP－P53（AS）－801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01）,流氏细胞仪检测PEGFP－P53（AS）－801D细胞G1期细胞数明显增加,出现G1期阻止的表现,MTT检测PEGFP－P53（AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论：有P53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显,对顺铂耐药,外源P53反义RNA可封闭突变蛋白表达,抑制801D细胞体外恶性增殖,增加对顺铂的药物敏感性,证明P53突变的恶笥表型可以被抑制或野生型P53功能可得到恢复。     

shRNA抑制EZH2基因表达对膀胱癌细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术下调EZH2基因表达对膀胧癌细胞增殖的影响。方法设计、合成EZH2基因小发夹RNA（shRNA）表达载体,用脂质体包裹并转染膀胱癌EJ细胞。RT-PCR和免疫组化法检测基因沉默效果,细胞克隆形成检测细胞生长情况,流式细胞仪测定细胞周期。结果EZH2的shRNA表达载体能有效下调EJ细胞的EZH2基因表达,并显著抑制EJ细胞生长,EJ细胞周期发生G1期阻滞。结论RNAi技术可显著下调EJ细胞的EZH2基因表达,阻止EJ细胞进入S期并抑制其增殖。     

外源性p16基因对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的：研究外原性p16基因对肺癌细胞生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导的基因转染方法将外源性p16基因转入p16基因缺陷的人肺腺癌细胞株A549中,用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）及免疫组化的方法检测p16基因的表达,同时观察转染后细胞恶性生长的变化。结果：外源性p16基因在A549细胞中能稳定表达,转染后A549细胞生长速度明显减慢,在软琼脂上形成克隆的能力降低。流式细胞仪检测显示A549细胞G1期阻滞并发生了凋亡,接种裸鼠后致瘤性降低,肿瘤生长明显减慢。结论：外源性p16基因导入人肺癌细胞株A549中可稳定表达并抑制细胞的恶性生长,同时诱导调亡。     

RNAi沉默Notch1基因对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用

目的采用RNA干扰(RNAi)技术抑制Notch1基因的表达,观察阻断Notch信号通路对人骨肉瘤细胞MG63的促凋亡作用及其机制。方法构建mNotch-1短发夹状RNA(mNotch-1 shRNA),利用MTT增殖试验分析mNotch-1 shRNA转染前及转染24、48、72 h时MG63细胞的增殖情况;通过Annexin V法染色和流式细胞术检测细胞凋亡率及与mNotch-1 shRNA作用时间的关系;Western blot检测细胞中Notch1、Bcl-2及Bax蛋白表达的变化。结果与对照组相比,mNotch-1 shRNA转染MG63细胞后,细胞增殖水平明显下降。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高。Western blot结果分析显示mNotch-1 shRNA转染MG63细胞后,细胞中Notch1基因表达明显降低,并且显著抑制Bcl-2基因和上调Bax基因的表达。结论 RNAi沉默Notch1基因能明显抑制人MG63细胞增殖,促进细胞凋亡;其作用机制可能与调控Bcl-2及Bax蛋白表达有关。     

Survivin-siRNA对裸鼠前列腺癌生长的影响

目的研究survivin-siRNA对前列腺癌裸鼠移植瘤生长的作用，探讨survivin与前列腺癌发生、发展的关系。方法人前列腺癌细胞PC-3M荷瘤裸鼠18只随机分为3组：mock组（n=6），psi-scrambled组（n=6）和pSi-sur2组（n=6）。通过电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内，20d后处死动物，计算抑瘤率。利用Western blot检测survivin蛋白表达水平，免疫组化SP法检测增殖指数变化；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡的变化。结果体内实验表明，pSi-sur2组与其他两对照组比较裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P〈0．01），肿瘤组织survivin蛋白表达及肿瘤增殖指数显著降低（P〈0．01），而肿瘤凋亡显著增加（P〈0．01）。结论通过RNA干扰技术抑制survivin的表达，在裸鼠体内可显著抑制前列腺癌生长。     

PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡的研究

目的 利用RNA干扰技术在裸鼠膀胱癌动物模型中通过抑制靶向沉默血小板源性内皮生长因子基因(PDECGF)的表达,探讨其在活体动物肿瘤组织中的作用.方法 将psiPDECGF-1及-2稳定转染的阳性T24细胞株及其他对照组直接接种于裸鼠皮下,观察肿瘤细胞生长及成瘤情况、测定肿瘤体积的变化;免疫组化检查PDECGF蛋白表达;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 裸鼠体内成瘤实验发现siRNA2组第21天时成瘤率只有50%,而其他各组成瘤率为100%.siRNA2组生长速度明显慢于其他3组,siRNA2组不仅成瘤延迟,且生长速度明显慢于其他3组(P＜0.01).免疫组化证实siRNA2组肿瘤组织PDECGF 蛋白表达最低; TUNEL检测siRNA2组细胞凋亡数明显多于其他3组 (P＜0.05).结论 PDECGF siRNA载体稳定转染细胞株体内实验可见膀胱癌细胞成瘤率降低,成瘤延迟及肿瘤生长速度减慢,癌细胞凋亡增多.PDECGF siRNA在裸鼠体内依然对膀胱癌细胞有明显抑制作用.     

RNA干扰介导转化生长因子β1沉默抑制大肠癌细胞生长

目的观察抑制转化生长因子（TGF）β1表达对大肠癌细胞生长周期和侵袭力的影响。方法用小片段TGFβ1的双链RNA（siRNA）转染大肠癌HCT116细胞，半定量RT—PCR法检测TGFβ1受抑程度，流式细胞仪观察转染后细胞周期变化，软琼脂克隆实验检测肿瘤细胞生长及成瘤性的变化。结果TGFβ1的小片段RNA转染显著抑制了肿瘤细胞TGFβ1的表达，使细胞HCT116的S期细胞较对照组明显增高59．0％～82．5％，进入G2期细胞减少；转染组细胞克隆形成率较对照组显著下降。结论RNA干扰技术可快捷方便地阻断TGFβ1表达，使大肠癌细胞S期阻滞并抑制肿瘤细胞生长、降低其成瘤性。     

干扰COX-2基因表达对人肺腺癌A2细胞体外恶性增殖的影响

背景与目的COX-2在多种肿瘤组织中高表达,参与了肿瘤的发生发展,RNA干扰（RNAi）技术是一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段。本研究应用RNAi技术研究干扰COX-2基因表达的抑制效果及抑制COX-2基因表达对A2细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2为靶点,构建3个带有人u6启动子的COX－2小干扰RNA（short interfering RNA,siRNA）表达载体。用脂质体lipofectamine介导,分别将3个siRNA表达载体及空载体转染到COX-2表达阳性的A2细胞,建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应（RT－PeR）和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究干扰COX-2基因表达对A2细胞体外增殖的影响。结果经过PCR扩增、内切酶鉴定、DNA测序和BLAST比对证实3个siRNA和u6启动予序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A2－3、A2—7、A2—10和A2－P。转染后24h、48h、72h,A2－P细胞均有绿色荧光表达．而A2—3、A2-7、A2－10细胞均未观察到绿色荧光。RT-PCR和Western blot结果显示,3个siRNA表达载体均发挥作用,COX～2表达受到抑制。与A2细胞比较,A2－3、A2－7、A2－10细胞的COX－2mRNA表达量分别降低15．6％、20．4％和64．2％,COX－2蛋白表达量分别降低23．7％、36．7％和60．2％。缀胞生长曲线、集落形成试验的结果显示,A2—10细胞生长减慢,集落形成率减少,而A2—3和A2-7细胞生长没有明显的改变。结论应用RNAi技术熄灭COX-2基因表达对A2细胞的体外恶性增殖有明显的抑制作用。     

shRNA干扰技术沉默VEGF表达治疗血管内皮瘤的实验研究

目的构建血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA真核表达质粒（shVEGF）,观察其对血管内皮瘤细胞系（EOMA）细胞体外增殖及动物实验的影响。方法构建真核表达质粒pGenesil-3-shVEGF并转染EOMA细胞,采用CCK-8法检测shVEGF对EOMA细胞增殖能力的影响。建立EOMA细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组和shVEGF组,肿瘤出现后,隔日测量瘤体体积,并观察体积变化。结果转染48h后EOMA细胞增殖受到抑制。体内实验显示经shVEGF治疗后,裸鼠皮下移植瘤体生长缓慢,体积明显缩小。结论RNA干扰技术实现VEGF基因沉默,能明显抑制EOMA细胞增殖及体内肿瘤生长,提示shVEGF在血管内皮瘤、血管瘤等血管瘤样病变的生物治疗中可能有较好的应用前景。     

鼠源性血管抑素基因转染对人肝癌细胞体内致瘤力的影响及新血管抑制作用

目的 研究血管抑素血管他丁（angiostatin）基因转染人肝癌细胞系HCC7721,对肿瘤细胞体外生长、周期分布、形态以及体内致瘤力的影响。探讨血管抑素的作用机制。方法 应用定向克隆技术构建鼠源性血管抑素血cDNA基因真核表达载体pcDNA3.1( )-angio,酶切鉴定和测序。采用脂质体基因转染技术将真核表达载体导入人肝癌细胞系HCC7721,新霉素G418筛选抗性克隆,设置转染空载体细胞为阴性对照和未转染细胞为空白对照。通过RNA点杂交和流式细胞荧光免疫检测血管抑素的表达,测定细胞生长曲线,计算细胞倍增时间,流式细胞仪检测细胞周期分布。建立动物模型,观察转染前后肿瘤细胞致瘤力的改变。免疫组化检测肿瘤组织微血管密度（MVD）和血管抑素体内表达。结果 成功构建带有碱基序列正确的血管抑素基因片段的重组真核表达载体pcDNA3.1（ ）-angio。分别转染脂质体/pcDNA3.1( ）-angio和脂质体/pcDNA3.1( ）的实验组,HCC7721肝癌细胞作阴性对照组经G418筛选,30d后均得到稳定的抗性细胞克隆,空白对照组在筛选1周后全部死亡。实验组HCC7721细胞在体内和体外均表达目的蛋白,而对照组细胞中无表达。与对照组相比,虽然实验细胞在体外的生长速度和细胞周期分布未发生明显改变。但在体内的致瘤力显著降低,瘤体增长缓慢,平均抑瘤率达47%。肿瘤MVD计数显示,实验组肝癌细胞形成的瘤体组织中MVD明显低于阴性对照组。结论 血管抑素不直接影响肝癌细胞HCC7721在体外的生物学特笥,但可强烈抑制体内肿瘤的形成,其机制可能是通过抑制肿瘤的新血管生成,间接发挥抑制肿瘤作用。     

RNA干扰抑制FAK基因表达对人胰腺癌细胞凋亡及吉西他滨敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制黏着斑激酶（FAK）基因表达增强人胰腺癌PANC-1细胞对化疗药物敏感性及凋亡能力的研究.方法 针对FAK mRNA序列设计合成短发夹状干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-FAK重组表达载体,转染人胰腺癌PANC-1细胞;通过RT-PCR分析其对PANC-1细胞内源性FAK表达的影响;激光共聚焦显微镜检测PANC-1细胞凋亡的形态学改变;用四甲基偶氮唑蓝法观察PANC-1细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变;采用分光光度计检测 Caspase 活性.结果 成功构建 pRNAT-FAK重组质粒,并成功转染PANC-1细胞;RT-PCR证实重组质粒在mRNA显著抑制FAK基因表达（P＜0.01）;吉西他滨组及吉西他滨加pRNAT-FAK组细胞则检测出明显的细胞凋亡;四甲基偶氮唑蓝结果证明在和吉西他滨联合作用下,pRNAT-FAK组PANC-1细胞的生长抑制率明显增高（P＜0.01）;Caspase 3活性明显高于空白对照绀和阴性对照组.结论 pRNAT-FAK可抑制FAK在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,并增强PANC-1细胞对吉西他滨敏感性.     

重组腺相关病毒介导的RNA干扰抑制血管生长素表达对肺腺癌细胞成瘤能力的影响

目的 通过腺相关病毒(AAV)介导的RNA干扰(RNAi)抑制肺腺癌细胞A549血管生长素(ANG)表达,观察其对癌细胞生长和成瘤能力的影响.方法 构建H1启动子驱动的表达针对ANG的小干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(AAV-shANG),转染A549细胞,同时以正常A549细胞以及转染AAV-Null的A549细胞作为对照,观察重组腺相关病毒介导的RNAi抑制ANG表达对A549细胞生长、致瘤、肿瘤细胞增殖、凋亡及肿瘤微血管密度的影响.用t检验分析各组间差别,所有数据均用x±s表示.结果 体外实验结果表明重组腺相关病毒AAV-shANG成功构建,重组腺相关病毒转染A549细胞72 h后ANG蛋白表达水平明显低于A549细胞组及AAV-Null组;转基因A549细胞细胞周期分析结果提示,正常A549细胞、AAV-Null转染细胞和AAV-shANG转染细胞的增殖指数(PI)分别为0.32±0.29、0.35±0.38和0.31±0.43,差异不明显.体内实验结果表明,AAV-shANG转染细胞组胸腺缺陷小鼠的成瘤体积、瘤质最均明显低于两对照组.各组微血管密度分别为9.4±1.5、9.8±2.1和5.7±1.9,提示AAV-shANG转染细胞组与正常A549细胞和AAV-Null转染细胞组有明显差异.各组凋亡细胞的百分率分别为(7.7±3.1)%、(8.5±5.4)%和(17.1±8.6)%.AAV-shANG转染细胞组凋亡细胞的百分率明显高于正常A549细胞组和AAV-Null转染细胞组,各组细胞增殖核抗原(PCNA)阳性表达率分别为(84.8±9.7)%、(85.8±9.8)%、(70.4±10.1)%,AAV-shANG转染细胞组PCNA表达率低于两对照组.结论 AVV-siRNA表达能显著抑制肿瘤细胞ANG表达及肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.     

Notch信号通路在肝癌中的研究进展

Notch信号通路存在于多种动物体内,其家族成员的结构具有高度保守性,在细胞分化和发育中发挥着关键作用,保持着细胞增殖、分化和凋亡三者之间的动态平衡。异常活化的Notch信号可促使正常细胞向恶性转化,失控的Notch信号与肿瘤细胞的生长相关,Notch信号在大多数情况下作为癌基因促进肿瘤生长,但也发挥着诱导细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

siRNA靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响

背景：肝癌衍生生长因子（HDGF）分离自人肝癌细胞株,其功能特性与多种肿瘤的生长、侵袭、转移和预后相关。目的：观察以小干扰RNA（siRNA）靶向抑制HDGF基因对人肝癌细胞株增殖和侵袭力的影响。方法：以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测人肝癌细胞株HepG2HDGFmRNA表达。构建靶向HDGF的短发夹RNA（shRNA）慢病毒表达载体．转染HepG2细胞．建立稳定表达siRNA-HDGF的HepG2细胞株。蛋白质印迹法检测siRNA—HDGF的干扰效率。MTT实验和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖情况,Boyden小室体外侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果：HepG2细胞中HDGFmRNA表达明显。蛋白质印迹法筛选出的干扰效率为75-3％的HepG2细胞株．生长速度较转染阴性对照载体和未转染载体的细胞显著减慢（P〈0．05）,在软琼脂上形成的集落数减少（9．64±1．62对36．41±1．68和35．50±3．27,P〈0．05）,穿过Boyden小室Matrigel基质胶的细胞数亦显著减少（51．27±6．53对153．80±10．04和154．33±10．23,P〈0．05）。结论：以siRNA靶向抑制HDGF基因能显著抑制人肝癌细胞株的增殖和侵袭力．HDGF可能成为肝癌基因治疗的重要靶标。     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

NF-κB信号通路阻断对内皮细胞增殖的抑制作用观察

目的观察内皮细胞的核转录因子（NF）-κB信号通路阻断对内皮细胞增殖的抑制作用。方法构建NF-κB p65的特异性小分子干扰RNA（siRNA）真核表达载体。取体外培养的大鼠主动脉内皮细胞（SVAREC细胞）,随机分为空白对照组、脂多糖（LPS）组、LPS＋HK组和LPS＋p65 siRNA组。除空白对照组外,均予1μg/mlLPS诱导孵育。LPS＋HK组和LPS＋p65 siRNA组分别转染无义序列HK和p65 siRNA真核表达载体。继续培养72 h后用Western blot法检测各组细胞p65蛋白,流式细胞术测算细胞周期,MTT法测算内皮细胞增殖指数及细胞增殖率。结果 NF-κB p65蛋白表达水平量LPS组为0.913±0.073,较空白对照组0.527±0.053明显增高（P〈0.05）;LPS＋HK组为0.926±0.065,与LPS组相比P〉0.05,LPS＋p65 siRNA组为0.473±0.071,与LPS组相比P〈0.05。LPS组G0/G1期细胞比例较空白对照组显著降低、S期细胞比例、细胞增殖指数及细胞增值率较对照组显著增高（P均〈0.05）;LPS＋p65 siRNA组细胞与LPS组相比G0/G1期比例显著增高,S期细胞比例、细胞增殖指数及细胞增殖率显著降低（P均〈0.05）,而LPS＋HK组与LPS组比较P均〉0.05。结论 NF-κB信号传导通路阻断可抑制内皮细胞增殖。     

siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,C y c l i n E m R N A和蛋白表达量均显著降低(P<0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P<0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.     

RNA干扰抑制EZH2基因表达对人胶质瘤细胞凋亡及对卡莫司汀敏感性的影响

目的观察RNA干扰技术抑制EZH2基因表达对人胶质瘤U251细胞凋亡及其对卡莫司汀敏感性的影响。方法针对EZH2 mRNA序列设计合成小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建pRNAT-EZH2重组表达载体,并用其转染人胶质瘤U251细胞。用RT-PCR法检测pRNAT-EZH2转染前后U251细胞中内源性EZH2表达;激光共聚焦显微镜观察转染后及加入卡莫司汀后U251细胞凋亡情况;MTT法检测转染前后U251细胞对化疗药物卡莫司汀敏感性;用分光光度法检测转染前后以及加入卡莫司汀后U251细胞中Caspase-3活性。结果成功构建pRNAT-EZH2重组质粒,并成功转染U251细胞。pRNAT-EZH2重组质粒转染后U251细胞中EZH2 mRNA表达量降低（P〈0.01）;卡莫司汀组及卡莫司汀加pRNAT-EZH2组U251细胞凋亡明显;与卡莫司汀联合时,pRNAT-EZH2组U251细胞生长抑制率明显增高（P〈0.01）;Caspase-3活性明显高于空白对照组和阴性对照组（P均〈0.01）。结论pRNAT-EZH2可抑制EZH2在人胶质瘤U251细胞中的表达,并增强U251细胞对卡莫司汀敏感性。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

Examining the role of Rac1 in tumor angiogenesis and growth: a clinically relevant RNAi-mediated approach

Angiogenesis, the sprouting of new blood vessels from the pre-existing vasculature, is a well established target in anti-cancer therapy. It is thought that the Rho GTPase Rac1 is required during vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. In the present study, we have used a clinically relevant RNA interference approach to silence Rac1 expression. Human umbilical vein endothelial cells were transiently transfected with non-specific control siRNA (siNS) or Rac1 siRNA (siRac1) using electroporation or Lipofectamine 2000. Functional assays with transfected endothelial cells were performed to determine the effect of Rac1 knockdown on angiogenesis in vitro. Silencing of Rac1 inhibited VEGF-mediated tube formation, cell migration, invasion and proliferation. In addition, treatment with Rac1 siRNA inhibited angiogenesis in an in vivo Matrigel plug assay. Intratumoral injections of siRac1 almost completely inhibited the growth of grafted Neuro2a tumors and reduced tumor angiogenesis. Together, these data indicate that Rac1 is an important regulator of VEGF-mediated angiogenesis. Knockdown of Rac1 may represent an attractive approach to inhibit tumor angiogenesis and growth.