抗小鼠Caspase-12小干扰RNA对肝细胞凋亡的抑制作用

目的观察抗小鼠Caspase-12小干扰RNA（siRNA）对小鼠原代肝细胞凋亡的抑制作用。方法原位二步灌流法分离并培养Balb／c小鼠原代肝细胞，化学合成制备三种抗Caspase-12不同位点（130，214，521）的SiRNA，脂质体包裹转染小鼠原代肝细胞。毒胡萝卜素4μmol／L诱导肝细胞凋亡。逆转录聚合酶链反应、Westeril blot检测抑制效果；四甲基偶氮唑盐法检测对细胞凋亡的影响。结果在浓度为100nmol／L时。siRNA（130）对小鼠原代肝细胞Caspase-12 mRNA的抑制率为0，siRNA（214）为52．08％，siRNA（521）为30．73％（t=4．30，P〈0．05）；在浓度为200nmol／L时，三种siRNA的抑制率分别为88．07％、86．22％，89．41％。200nmol／L的siRNA（214）对凋亡细胞procaspase-12的抑制率为51．43％（f=4．30，P〈0．01）；MTT比色实验发现，凋亡细胞活力增高48．76％（f=2．23，P〈0．01）。结论抗Caspase-12 siRNA对小鼠原代肝细胞凋亡有一定的抑制作用。     

siRNA沉默USP22基因对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)对胃癌细胞增殖的影响.方法:针对USP22基因设计3条siRNA及阴性siRNA,用脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌AGS细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测转染后AGS细胞USP22基因中mRNA和蛋白表达水平的变化情况,流式细胞术检测细胞周期分布变化情况,CCK8法检测细胞增殖率及抑制率.结果:转染48h后,3条siRNA均能显著抑制USP22 mRNA和蛋白的表达.其中,以转染USP22 siRNA3后效果最明显,mRNA和蛋白表达分别下降80.47%±2.99%和79.40%±3.58%.细胞增殖明显受到抑制,USP22 siR-NA3组细胞增殖抑制率为27.33%±3.49%.细胞周期中G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.结论:采用RNA干扰技术能够有效地沉默USP22基因的表达,并显著抑制胃癌细胞的增殖.     

siRNA对生长抑素基因表达的抑制作用

目的:研究siRNA对生长抑素(SOM)基因表达的抑制作用．方法:根据生长抑素基因序列设计和合成 RNA干扰的靶序列,应用RiboMAXT7体外转录试剂盒合成siRNA并转染胃癌细胞系 SGC-7901,经RT-PCR,免疫组化法检测生长抑素在mRNA和蛋白质水平的抑制效应．结果:成功合成了siRNA(21 bp)．胃癌细胞系 SGC-7901中SOM基因的表达呈强阳性,分布在胞质中,siRNA作用48 h后SOM基因的表达明显抑制,与空转染和空白对照组相比有显著性差异(49．71％±0．056％vs 10．49％±0．021％, 0％,P<0．01)．结论:siRNA可特异性抑制生长抑素基因的表达．     

siRNA分别阻断Notch各亚型对哮喘模型小鼠肺T细胞分化的影响

目的:研究以小干扰RNA(siRNA)阻断Notch1、Notch2、Notch3和Notch4各亚型对支气管哮喘(哮喘)模型小鼠肺T细胞分化的影响,比较Notch各亚型在肺T细胞分化中的不同作用,探讨Notch信号通路与哮喘发病的关系。方法:本研究为实验研究。制作哮喘小鼠模型,从肺组织中分离T细胞。在培养过程中分别采...     

约氏疟原虫感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用

目的观察约氏疟原虫17XL虫株感染对小鼠黑色素瘤的抑制作用。方法取C57BL/6小鼠20只,腋下注射传代培养的B16F10黑色素瘤细胞;次日,将小鼠随机分为约氏疟原虫(P.y)感染组和对照组2组,10只/组;P.y感染组小鼠每只腹腔注射1×106个含虫红细胞率为20%的小鼠红细胞;对照组小鼠腹腔注射等量的C57BL/6小鼠正常红细胞。观察两组小鼠黑色素瘤出瘤时间并测量肿瘤的体积。结果 P.y感染组小鼠黑色素瘤出瘤时间为注射黑色素瘤细胞后(11.30±0.21)d,晚于对照组[(10.40±0.22)d](P0.05);自可精确测量瘤体起至实验终点,2组小鼠肿瘤均不断增长,P.y感染组瘤体体积均显著小于对照组(P均0.05);P.y感染组瘤体生长速度为(71.10±6.29)mm3/d,明显慢于对照组[(302.80±49.94)mm3/d](P0.05),且P.y感染组肿瘤每日生长速度亦明显慢于对照组(P均0.05)。结论约氏疟原虫感染可以延缓肿瘤出瘤时间,且对小鼠黑色素瘤瘤体的增长具有明显的抑制作用。     

老年原发性食管恶性黑色素瘤临床特征的研究

原发性食管恶性黑色素瘤是一种罕见的高度恶性肿瘤,国内外文献报道较少,对该病发生、发展规律的认识不够深入和明确,尤其对于老年患者更缺少此方面的研究.     

miR-205对黑色素瘤A375细胞增殖、黏附和迁移的影响及机制探讨

目的探讨miR-205对人皮肤恶性黑色素瘤细胞系A375增殖、黏附和迁移的影响及其可能机制。方法将miR-205 mimics用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染A375细胞,CCK-8法测细胞增殖变化;细胞黏附实验和划痕实验检测细胞黏附和迁移能力变化。Western blot检测PTEN、总AKT和磷酸化AKT蛋白表达变化。结果上调miR-205表达后实验组的细胞增殖、黏附和迁移能力均比空白对照组和阴性对照组减低(P均<0.05);Western blot结果显示上调miR-205表达能增加PTEN蛋白表达,减低磷酸化AKT蛋白水平,但对非AKT蛋白表达无影响。结论 miR-205可能通过调控PTEN/AKT通路抑制黑色素瘤细胞的增殖、黏附和迁移能力。     

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对肝癌细胞的体外抑制作用

目的 研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞SMMC-7721中抗肿瘤作用。方法 针对hTERT基因编码区及非编码区，采用T7转录系统在体外合成了2条siRNA，转染SMMC-7721细胞。以四甲基偶氮唑盐试验、逆转录聚合酶链反应及western blot观察其对SMMC-7721细胞增殖、hTERT mRNA及蛋白表达的影响。结果 2条siRNA以剂量依赖性方式抑制了SMMC-772l细胞增殖，当给药浓度为100nmol／L时，对hTERT mRNA及蛋白表达有明显的抑制作用。结论 靶向hTERT的siRNA对hTERT基因表达有抑制效果，有可能发展为一种新的抗肿瘤药物。     

红景天苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的：观察红景天苷对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖及凋亡的影响。方法分别用0、0．01、0．1、1、10、100μg/mL红景天苷处理人恶性黑色素瘤细胞A375后,MTT法检测各组细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测各组细胞周期依赖性激酶CDk4和CDk2 mRNA、细胞周期素CyclinE和CyclinD1 mRNA的影响。结果与阴性对照组比较,各给药组细胞增殖抑制率明显增多（P＜0．05）。给药组细胞以G0/G1期为主,S期细胞增加,G2/M期细胞减少（P＜0．05）。给药组中的CDk2、 CDk4、CyclinD1和CyclinE mRNA表达较阴性对照组明显降低（P＜0．05）。结论红景天苷能够抑制人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和促进其凋亡。     

siRNA在内分泌疾病治疗中的研究及应用

小干扰RNA(siRNA)是一种序列特异性的、在转录后水平调控基因表达的小RNA(small RNA)分子.实验研究证实,siRNA可有效用于治疗骨质疏松、内分泌肿瘤以及糖代谢异常、肥胖、糖尿病慢性并发症、脂代谢异常等代谢性疾病.siRNA药物治疗内分泌疾病的临床研究目前主要集中于代谢性疾病,如siRNA药物bevasiranib已进入治疗糖尿病视网膜病变(黄斑水肿)的Ⅱ期临床试验.     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.     

Notch1信号通路对胃癌细胞增殖的影响

目的探讨Notch1信号通路对体外培养的胃癌细胞(BGC-823)增殖的影响,为胃癌的治疗提供新思路。方法将体外培养的胃癌细胞株BGC-823分为三组,空白组加入PBS缓冲液,激活剂组加入Notch1通路激活剂rh-NF-κB,抑制剂组加入Notch1通路抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ。Western blot法检测各组Notch-1和Hes-1蛋白表达;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期分布。结果与空白组比较,激活剂组Notch-1和Hes-1呈高表达、抑制剂组呈低表达;激活剂组细胞增殖减低,抑制剂组增殖旺盛;激活剂组S期胃癌细胞所占比例低,抑制剂组所占比例高。P均<0.05。结论 Notch1信号通路激活能抑制胃癌细胞增殖。     

miRNA沉默缺氧诱导因子1α基因对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的 探讨以miRNA沉默缺氧诱导因子1 α(HIF-1 α)基因,观察其对肝癌细胞株(HepG2细胞)增殖的抑制作用.方法 构建靶向HIF-1 α基因miRNA干扰载体,转染HepG2细胞,以定量PCR和Western blot分析靶基因和蛋白的表达;构建含缺氧反应元件双荧光素酶报告基因检测转染后相对光单位值;酶联免疫吸附法定量检测血管内皮生长因子和血管生成素2的表达;细胞凋亡及增殖周期以流式细胞仪和膜联蛋白/碘化丙啶(V-FITC/PI)双重染色法分析.采用t检验和两因素方差分析及q或q'检验分析计量资料.结果 HepG2细胞在转染HIF-1 αmiRNA后72 h,HIF-1 α在转录和翻译水平上分别下降87%和56%双荧光素酶报告基因减少46%,血管内皮生长因子和血管生成素2分别减少54%和36%;癌细胞凋亡率为22.46%±0.61%(P＜0.01),G1和S期比例分别为61.49%±1.12%和22.40%±0.58%;联合阿霉素处理后,凋亡率增至36.99%±0.88%,G1、S期比例分别为65.68%±0.91%和19.47%±1.34%.结论 HIF-1 α miRNA可抑制HIF-1 α基因表达,联合阿霉素有效调控肝癌细胞周期,促进凋亡、抑制增殖.

Abstract：

Objective To investigate the effect of miRNA silencing HIF-1 α gene on the proliferation of HepG2 cells. Methods The eukaryotic expression plasmids of HIF- 1α miRNA and report gene containing hypoxia-reponse element were constructed and trasnfected into HepG2 cells. The expressions of HIF-1 α gene and protein were determined by real time-PCR and Western blotting. The expressions of HIF1 α, vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin-2 (Ang-2) were quantitatively detected by ELISA. The alterations of cell cycles and apoptosis rate were quantitatively measured by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI double dyeing assay. Results 72 h after transfection the downregulations of HIF-1 α mRNA and protein were 87% and 56% respectively, and the decrease of target gene was 46% in the report gene, 54% in VEGF and 36% in Ang-2, respectively. The apoptotic ratio of HepG2 cells was 22.46 ± 0.61%(P ＜ 0.01). The cell cycle changed greatly at the ratio of G1 (61.49 ± 1.12%) and S (22.40 ± 0.58%, P ＜0.01). After being combined with doxorubicin, the apoptotic ratio increased to 36.99 ± 0.88% and the ratios of G1 and S phases were upregulated to 65.68 ± 0.91% and 19.47 ± 1.34% respectively. Conclusion HIF-1α miRNA or / and doxorubicin can regulate the growth cycles of HepG2 cells, promote the cell apoptotosis and inhibit the cell proliferation.     

Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨

目的 观察Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖和凋亡中的作用,并探讨其机制.方法 将U87细胞随机分为A、B、C组,分别加入Notch信号激活剂rhNF-κB、抑制剂DAPT及PBS共培养48 h.用MTT法检测细胞吸光度值(A值)观察细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法分别检测U87细胞中的Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白.结果 培养24、48、72、96 h,A组细胞A值分别为0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031,B组分别为0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003,C组分别为0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016,A、B组与C组比较,P均＜0.05.A、B、C组细胞凋亡率分为0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.40％,A、B组与C组比较,P均＜0.05.与C组比较,A组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著增加(P均＜0.05),B组细胞中Notch1、Hes1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P均＜0.05).结论 Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中发挥了重要的调控作用,其机制可能与调节靶基因Hes1、抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关.     

调控Notch信号对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC-T6)内是否存在功能激活的Notch信号分子以及调控Notch信号转导对HSC-T6活化的影响. 方法 用PCR方法检测Notch信号分子mRNA在HSC-T6细胞内的表达,TaqMan探针检测转化生长因子(TGF)β 1刺激HSC-T6后Notch信号分子的表达变化.细胞免疫荧光法检测Notch3和Jagged1在HSC-T6内的表达定位.用携带Notch3胞内域(ICD)的真核表达质粒pcDNA3.1-N3ICD和特异性干扰Notch3的siRNA(Notch3-siRNA)分别转染HSC-T6细胞,Western blot检测Notch3、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅰ型胶原的表达变化.对数据采用t检验和方差分析. 结果 HSC-T6细胞内存在功能激活的Notch信号转导.TGF β 1(2.0 ng/ml)刺激HSC-T6导致Jagged1、Notch3和HES-1的mRNA水平明显上调,分别提高了2.9、3.2、2.2倍,F值分别为2543.482,287.982和1719.851,P值均＜0.01.pcDNA3.1-N3ICD转染后促使HSC-T6合成α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白增加,较对照组分别提高了5.8倍和4.5倍,t值分别为13.157和9.810,P值均＜0.01;相反,Notch3- siRNA明显抑制HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,较对照组分别下降了约90％和84％,t值分别为19.863和10.376,P值均＜0.01.而且,Notch3-siRNA能拮抗TGFβ1诱导HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原的作用.结论 Notch信号通路可能通过调控肝星状细胞的活化参与肝纤维化的形成,选择性地干预Notch3信号转导可能成为抗肝纤维化的新途径.     

BCLl1A-siRNA对HEK293细胞增殖的影响

目的设计靶向B细胞淋巴瘤／白血病11A基因的小干扰RNA（BCLllA-siRNA）,并观察其对人胚胎肾细胞株HEK293细胞增殖的影响。方法利用siRNATargetFinder工具,针对BCLllA设计合成siRNA319、siRNA585、siRNA2292、siRNA475。将HEK293细胞接种不含抗生素的培养基中,分为阳性对照组（Pc组）、阴性对照组（NC组）、BCLllA-siRNA319组（si319组）、BCLllA-siRNA585组（si585组）、BCLllA-siRNA2292组（si2292组）、BCLllA-siR-NA475组（si475组）、空转组、细胞组。通过Lipofectamine^TM2000,si319组将siRNA319、si585组将siRNA585、si2292组将siRNA2292、si475组将siRNA475分别转染HEK293细胞;转染后6h倒置荧光显微镜观察细胞转染情况并用流式细胞仪检测转染效率;转染后24、48、72h,采用实时定量RT—PCR法观察BCLllA-siRNA对BCLllA基因表达的影响;CEK8法观察HEK293细胞体外增殖情况。结果转染后24h,si585组、si2292组的HEK293细胞BCLllA基因表达降低,72h逐渐恢复;si585组、si2292组细胞增殖受抑,与NC组、空转组、细胞组相比,P均〈0．05。结论BCLlIA．siRNA585及BCLllA．siRNA2292可降低HEK293细胞中BCLllA基因表达,抑制细胞增殖。     

反义及小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用

目的观察以腺相关病毒（AAV）为载体，含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1的反义RNA及小干扰RNA（siRNA）的重组AAV（rAAV／ANTI-TIMP—1／neo及rAAV／siRNA—TIMP—1／neo）感染大鼠肝星状细胞系HSC—T6后，TIMP—1表达的受抑制情况。方法经聚合酶链反应（PCR）扩增及酶切后连接，将针对TIMP—1的反义RNA片段及甄RNA片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定，将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSC—T6，同时设空白对照组。经G418以400ug／m1的浓度筛选30d后，分别应用荧光定量PCR技术及Westernblot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平。结果经PCR、酶切及序列测定证实，两种重组AAV载体质粒（pd16-95／ANTI—TIMP-1／neo和pd16—95／siRNA-TIMP-1／neo）克隆成功。将重组质粒包装成病毒感染HSC—T6细胞30d后，通过荧光定量PCR技术及Westernblot分析显示，重组病毒rAAV／siRNA-TIMP-1／neo组与对照组细胞相比，HSC—T6中的TIMP-1基因的转录被抑制（P〈0．01），且表达水平与对照组相比约下降60％。而rAAV／ANTI—TIMP—1／neo组及空载体组与对照组相比TIMP—1基因的转录及表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论通过AAV载体技术重组病毒rAAV／siRNA-TIMP—1／neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达，而针对TIMP—1基因全长的重组病毒rAAV／ANTI—TIMP—1／neo对体外培养的HSC—T6细胞TIMP—1基因的转录与表达无明显抑制作用。     

小干扰RNA靶向突变K-Ras基因对人胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响

背景与目的研究显示ras基因活化可促使肿瘤细胞分泌多种细胞因子,而ras基因与TGFβ1基因表达之间的关系还未可知。本研究利用小干扰RNA敲除突变k-ras基因,探讨突变k-ras基因对TGFβ1表达及分泌的影响。方法小干扰RNA瞬时转染靶向突变k-ras后,应用real-time PCR和Western blot方法检测胰腺癌细胞株CFPAC-1、Aspc-1中ras mRNA和蛋白的表达;应用real-time PCR和流式细胞仪检测对胰腺癌细胞TGFβ1表达的影响;应用ELISA方法检测转染前后胰腺癌细胞上清液中TGFβ1浓度。结果①以人已知基因无影响的序列阴性对照组为基准计算k-ras mRNA的相对表达量,实验组胰腺癌细胞CFPAC-1和ASPC-1转染后k-ras mRNA表达明显减低,k-ras mRNA表达在转染后48h为最低,抑制率达(75.33±5.50)%。Western blot检测各组质粒转染的细胞ras蛋白表达,结果显示实验组ras蛋白量较转染试剂对照组、已知基因无影响的序列阴性对照组明显降低。②Real-timePCR结果显示实验组CFPAC-1和ASPC-1细胞转染后,TGFβ1mRNA表达量(CFPAC-10.68±0.08;Aspc-10.59±0.09)明显降低(P0.05)。而流式细胞仪结果显示TGFβ1蛋白表达降低(CFPAC-1组0.30±0.08,ASPC-1组0.33±0.10,P0.05)。③ELISA法检测实验组CFPAC-1上清液TGFβ1浓度为(1906.87±50.75)ng/ml,较阴性对照组(2072.79±96.98)ng/ml有所降低(P=0.036);实验组Aspc-1细胞上清液TGFβ1浓度(851.47±41.08)ng/ml,较阴性对照组(950.93±31.34)ng/ml有所降低(P0.05)。结论人胰腺癌细胞CFPAC-1、Aspc-1中TGFβ1mRNA和蛋白的表达与ras基因相关。TGFβ1可能是ras基因活化后驱动胰腺癌发生及演变的重要物质。本研究为k-ras突变的胰腺癌治疗提供有益的信息。     

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达,观察其对细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA,转染胰腺癌细胞PANC1.设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组.实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞的增殖率;ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性;Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达.结果 与未转染组相比,shRNA组转染后48 h,PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%;细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%;caspase-3和caspase-9酶活性显著增高;Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调.结论 应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达,其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关.