针对AKT2的小分子干扰RNA抑制胶质瘤细胞的增殖

目的比较靶向性丝/苏氨酸激酶2(AKT2)不同的小分子干扰RNA构建体对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用.方法选择大鼠AKT2的3个siRNA靶序列构建靶向AKT2的siRNA表达质粒,进行对C6细胞的AKT2表达及增殖抑制的研究,蛋白印迹检测AKT2的表达水平,TUNEL法分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞周期变化,3H-TdR掺入法分析细胞增殖.结果转染siRNA表达质粒组AKT2表达下调72%、88%和91%.各转染组的凋亡率明显增加(x2=34.218,P＜0.001),转染后S期指数较对照细胞明显减少,转染组细胞自第2天起存活率均明显下降(P＜0.01),且各个转染组之间存活率也有极显著性差异(P＜0.01),以尾部调节结构域转染组最显著.结论靶向AKT2的siRNA表达质粒可以特异性地抑制AKT2的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

miR-204通过下调Bcl-2和Sirt1表达抑制肝癌细胞生长

目的探讨微小RNA 204(miR-204)在肝细胞癌中的表达、临床意义及可能分子机制。方法收集手术切除的60例肝细胞癌及对应癌旁肝组织,实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-204在肝癌及癌旁组织中的表达,免疫组织化学染色检测miR-204下游潜在靶点Bcl-2与组蛋白脱乙酰酶1(Sirt1)的表达;用人工合成的miR-204模拟物转染人SMMC-7721肝癌细胞,MTT法及流式细胞术检测SMMC-7721细胞的增殖、凋亡的情况,qRT-PCR、Western blot法分别检测Bcl-2与Sirt1的mRNA和蛋白表达。结果 miR-204在肝癌组织中表达水平显著低于对应癌旁组织;肝癌组织中miR-204低表达与肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤TNM分期显著相关;miR-204低表达组Bcl-2与Sirt1蛋白表达显著高于miR-204高表达组,相关性分析结果显示肝癌组织中miR-204与Bcl-2、Sirt1蛋白表达呈显著负相关;miR-204可显著抑制SMMC-7721细胞的增殖并促进其凋亡,并下调Bcl-2与Sirt1的mRNA与蛋白表达水平。结论 miR-204在肝癌组织中表达下调并与肝癌恶性临床病理特征有关,miR-204抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡的作用可能与下调Bcl-2和Sirt1表达有关。     

小干扰RNA的设计及原理

RNA干扰技术在人类基因功能研究、药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。但只有设计合理的小干扰RNA (siRNA)才能高效、特异地抑制靶基因表达。本文总结了siRNA序列的一般特点以及设计siRNA的方法和相应原理,并介绍了如何利用实验手段,验证RNA干扰的有效性及特异性。从而促进RNA干扰技术的广泛开展。     

HIF-1α基因RNA干扰对肝癌HepG2细胞VEGF表达的抑制

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞缺氧反应网络的关键调节转录因子,而HIF-1α是决定HIF-1 活性的亚单位.HIF-1能在缺氧条件下促进血管内皮生长因子(VEGF) 依赖性的肿瘤血管形成.本研究构建了针对HIF-1α的pSUPER-EGFP siRNA表达载体,抑制HepG2细胞HIF-1α的表达.RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测结果显示,RNA干扰能明显抑制HIF-1α的表达;在缺氧培养条件下,HepG2细胞中VEGF有较高的表达,当HIF-1α基因表达被有效抑制,VEGF mRNA和蛋白质的表达随之大幅下降.本研究结果表明,HIF-1α是血管生成因子VEGF表达的调节因子,通过RNA干扰导致的HIF-1α基因抑制,能下调VEGF的表达,提示HIF-1α基因可作为抗抑制VEGF依赖性的肿瘤血管生成的一个靶点.     

HIF-1基因RNA干扰对肝癌HepG2细胞VEGF表达的抑制

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞缺氧反应网络的关键调节转录因子,而HIF-1α是决定HIF-1活性的亚单位。HIF-1能在缺氧条件下促进血管内皮生长因子(VEGF)依赖性的肿瘤血管形成。本研究构建了针对HIF-1α的pSUPER-EGFP siRNA表达载体,抑制HepG2细胞HIF-1α的表达。RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测结果显示,RNA干扰能明显抑制HIF-1α的表达;在缺氧培养条件下,HepG2细胞中VEGF有较高的表达,当HIF-1α基因表达被有效抑制,VEGF mRNA和蛋白质的表达随之大幅下降。本研究结果表明,HIF-1α是血管生成因子VEGF表达的调节因子,通过RNA干扰导致的HIF-1α基因抑制,能下调VEGF的表达,提示HIF-1α基因可作为抗抑制VEGF依赖性的肿瘤血管生成的一个靶点。     

联合靶向小干扰RNA对疱疹病毒2感染的体外抑制作用

目的 探讨联合靶向特异性小干扰RNA(siRNA)对疱疹病毒(HSV)2的体外特异抑制作用.方法 将体外合成的靶向HSV-2编码包膜糖蛋白gB的UL27.2基因、靶向DNA结合蛋白UL29.2基因的siRNA和该两种联合靶向特异性siRNA制剂,共转染Vero细胞并感染HSV-2,观察靶基因的表达情况、Vero细胞病变、空斑减数实验和子代病毒滴度并进行各组间比较:结果特异性UL27.2siRNA、UL29.2 siRNA和联合siRNA转染Vero细胞后,均能不同程度抑制各HSV-2临床株感染所导致的细胞病变,对病毒增殖抑制率分别为63.9%、86.7%和93.3%.实时定量PCR检测各组siRNA分别对UL27.2和UL29.2两个基因的表达,结果显示UL27.2 siRNA和UL29.2 siRNA对各自的靶向基因均有抑制,而联合靶向siRNA制剂对两个基因的抑制率最高.结论 联合靶向特异性siRNA制剂能有效抑制HSV-2的感染和复制.     

HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

背景：人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人的主要组织相容性复合物,在移植排斥反应中起关键作用。降低HLA的表达,可以延长移植物的存活时间。目的：设计HLA-A2小干扰RNA,检测其对HLA-A2表达沉默的作用。方法：设计4种HLA-A2 siRNA靶点序列构建其慢病毒表达体系,体外感染HLA-A过表达的293T细胞,观察4种靶点的敲减效率并筛选出有效靶点序列。体外培养人胚肺成纤维细胞,并用携带目的干扰序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察感染效率,应用Western blot检测在人胚肺成纤维细胞中对HLA-A2表达沉默的作用。结果与结论：根据Genbank中HLA-A2的mRNA序列,设计合成了3个小干扰RNA,在体外能有效的沉默HLA-A2在293细胞中的表达,将基因序列亚克隆入干扰载体后感染人胚肺成纤维细胞,也能有效的沉默HLA-A2的表达,效率达80%左右。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

RNA干扰endophilin A2抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞

 目的:探讨内吞蛋白(endophilin)A2对大鼠海马神经元突触囊泡内吞的影响。方法:设计干扰endophilin A2的小分子干扰片段,通过Western blot的方法筛选出针对endophilin A2有效的特异性干扰片段;用免疫荧光的方法验证干扰片段对神经元内源性endophilin A2的干扰效果;利用双全细胞膜片钳的方法,记录不同刺激方案下的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)的情况,以明确endophilin A2对突触囊泡循环的影响。结果:(1)免疫荧光结果显示endophilin A2的干扰片段能显著减少海马神经元内源性endophilin A2的表达(P<0.05);(2)双全细胞膜片钳结果显示,0.1 Hz的低频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元EPSCs大小与阴性对照组没有明显差异;而无论是单串高频刺激下还是多串高频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元标准化EPSCs的下降程度都明显增强(P<0.05)。结论:(1)成功筛选出特异性干扰endophilin A2的有效干扰片段;(2)干扰endophilin A2的表达不影响海马神经元突触囊泡胞吐;(3)干扰endophilin A2的表达可抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞。     

RNA干扰Skp2基因抑制T47D乳腺癌细胞生长

目的构建S期激酶相关蛋白2（skp2）RNA干扰真核细胞表达载体,研究skp2基因沉默对乳腺癌T47D细胞生长的抑制作用。方法应用Ambion公司在因特网上的设计程序设计小干扰RNA。构建3个不同的重组体转染T47D细胞,RT-PCR和Western Blotting检测skp2基因表达,细胞计数分析Skp2RNA干扰对肿瘤细胞增殖的影响。结果重组体经PCR和测序证实准确连接。转染重组体的细胞skp2的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降。重组体转染的细胞增殖明显降低。结论用RNA干扰下调skp2表达抑制乳腺癌细胞生长,skp2可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。     

小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD28基因表达的研究

目的 :为了探讨体外转录法合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA ,siRNA)对人淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因表达和功能的影响。方法 :设计并合成 3条siRNA(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3) ,在阳离子脂质体的介导下转染淋巴细胞。于转染后 2 4、4 8、72小时收集细胞 ,用半定量RT PCR方法检测CD2 8mRNA的变化 ;流式细胞仪检测CD2 8表达的变化。结果 :体外合成的 3条siRNA通过脂质体转染淋巴细胞后 ,均能不同程度地抑制共刺激分子CD2 8的表达。转染后 4 8小时的流式细胞仪检测显示siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3组的CD2 8表达抑制率分别为 2 2 10 %± 1 6 3%、73 5 0 %± 1 0 2 %和 4 2 90 %± 0 89% ,以siRNA 2的CD2 8抑制作用最强。半定量RT PCR检测显示siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3转染后淋巴细胞的CD2 8mRNA均受到不同程度的抑制 ,其中siRNA 2组的抑制作用最明显 (74 10 %± 1 6 5 % )。结论 :siRNA可特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因的转录和表达 ,从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受及防治GVHD方面的应用提供了理论和实验基础。     

病毒RNA干扰抑制因子研究进展

RNA干扰是真核生物体内普遍存在的一种高度保守的基因转录后水平的调控方式,它通过核酸序列特异性作用来抑制靶基因的表达.生物细胞利用RNA干扰机制来防御病毒的侵染,而许多病毒也能够产生RNA干扰抑制因子来对抗这种防御反应,这些抑制因子对宿主细胞有多种效应,往往同时是病毒重要的致病因子.迄今已从动植物病毒中鉴定出了多种RNA干扰抑制因子,抑制因子的鉴定和作用机理研究已成为病毒与宿主相互关系研究中的一个热点.本文对RNA干扰在动植物抗病毒中的作用、病毒RNA干扰抑制因子的发现、作用机理、鉴定方法以及研究意义等方面的最新进展进行了综述.     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

Stathmin 1 RNA干扰载体的构建及功能检测

目的 构建用于stathmin 1 RNA干扰的重组质粒并验证其干扰效果,初步探讨stathmin 1 对于黑色素细胞生长的影响.方法 两步PCR法构建含有shRNA编码序列的重组质粒,脂质体转染黑色素细胞.RT-PCR、Western 印迹等方法检测stathmin 1在黑色素细胞中表达水平改变;MTT、流式细胞仪等方法检测黑色素细胞生长状态.结果 成功构建3个stathmin 1特异性的RNA干扰载体,在黑色素细胞中能有效降低stathmin 1在mRNA水平的表达,蛋白质表达水平分别降低为对照组的6 %、17 %和15 %;黑色素细胞的生长由于stathmin 1 减弱表达而受到明显抑制,凋亡率提高到约60 %.结论 干扰质粒能有效介导stathmin 1的RNA干扰;stathmin 1对于黑色素细胞的生长具有重要意义.     

小干扰RNA靶向沉默CXCR2基因抑制肝癌细胞的增殖

目的 研究CXCR2-小干扰RNA（siRNA）基因体外抑制肝癌细胞增殖的作用.方法 将CXCR2-siRNA以脂质体转染法转染肝癌细胞hepG2,24h后荧光显微镜观察细胞荧光含量.采用RT-PCR及免疫印迹法分别检测正常肝Chang细胞、未转染肝癌hepG2细胞以及转染CXCR2-siRNA基因后hepG2细胞在转染24、48、72h后的CXCR2 mRNA和蛋白表达水平.以未转染的hepG2细胞为对照,CCK8法检测转染CXCR2-siRNA的hepG-2细胞在转染24、48、72 h后的增殖.以未转染的hepG2细胞为对照,检测转染CXCR2-siRNA 24 h后hepG2细胞与Transwell小室孵育24h时的侵袭能力.结果 CXCR2-siRNA转染hepG2 24 h后镜下可见大量绿色荧光,转染率为80％.hepG2细胞CXCR2mRNA和蛋白表达水平高于Chang细胞（mRNA：1.69±0.22比0.63±0.31,蛋白：1.93±0.25比0.84±0.29,均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后hepG2细胞CXCR2mRNA表达量低于未转染的hepG2细胞（0.75±0.24、0.83±0.21比1.78±0.25,均P＜0.05）,72 h后CXCR2-siRNA虽然仍能抑制hepG2细胞CXCR2mRNA的表达,但与未转染的hepG2细胞相比差异并无统计学意义（1.35±0.18比1.78±0.25,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后的hepG2细胞CXCR2蛋白表达低于未转染的hepG2细胞（0.91±0.25、1.16±0.23比1.98±0.31,均P＜0.05）,转染72 h后蛋白水平有所上升,与对照组相比差异无统计学意义（1.71±0.18比1.98±0.31,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义.与未转染的hepG2细胞相比,转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞增殖受到抑制（均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA的hepG2细胞对Transwell小室的侵袭能力明显低于未转染的hepG2细胞[（36±5）个腐倍视野（＆#215;200）比（526±9）个府倍视野（＆#215;200）,P＜0.05].结论 siRNA沉默CXCR2基因体外可有效抑制肝癌细胞的增殖.     

应用RNA干扰抑制乙肝病毒X基因促HepG2细胞凋亡的作用

目的:构建靶向乙肝病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并应用其体外抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用.方法:设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72小时后,分别以RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测HBX的表达量.Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞的凋亡变化.结果:重组质粒pSilencer3.1-shHBX酶切鉴定和测序结果均与设计的一致.该质粒使HBX基因mRNA表达量降低了47.1%,进而使HBx蛋白表达量降低了58.9%,HBx蛋白荧光强度减弱,并使HBX 诱导的HepG2细胞凋亡率降低了52.11%.而阴性对照质粒无此作用.结论:成功构建靶向HBX shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并可应用其抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用.     

RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

目的：构建乙型肝炎病毒前C／C基因小发夹RNA（shRNA）表达载体，探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法：用基因重组技术构建shRNA表达载体，经酶切、测序鉴定后，与HBeAg表达载体pcDNA3．1-preC／C按7：1的比例，共转染HeLa细胞，采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验（MEIA）分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果：经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体；筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用，对mRNA的抑制率为75％，对蛋白质的抑制率为53％，其余两序列无明显抑制作用。结论：RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3．1-preC／C表达HBeAg。     

携带甲胎蛋白基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对靶基因的沉默效率

目的构建携带甲胎蛋白（AFP）基因小干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体并转染肝癌细胞,评价其对AFP基因的沉默效率。方法设计和构建针对AFP基因的阳性siRNA及不针对任何已知基因的阴性siRNA,将其分别插入携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒载体,然后转染到表达AFP基因的人肝癌细胞HepG2并筛选阳性表达细胞株,分别为慢病毒转染阳性siRNA组和慢病毒转染阴性siRNA组。同时设立脂质体转染阳性siRNA组、脂质体转染阴性siRNA组以及加AFPsiRNA而未用转染试剂的siRNA组、空白对照组。荧光显微镜观察评估转染效率,荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组HepG2细胞APFmRNA及蛋白的相对表达量,比较不同转染方法对AFP基因表达的抑制率。结果慢病毒能够有效地转染siRNA到HepG2细胞内。荧光定量PCR显示慢病毒转染siRNA对AFPmRNA表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（92．1％比74．3％,P〈0．05）。免疫印迹亦显示慢病毒转染siRNA对AFP蛋白表达的抑制率显著高于脂质体转染siRNA（88．2％比63．7％,P〈0．05）。结论慢病毒转染AFPsiRNA能够更有效地抑制HepG2细胞内AFP基因表达。     

RNA干扰体内抑制HBeAg表达

目的 在机体水平观察小干扰RNA(siRNA)对HBeAg表达的影响.方法 通过尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测HBeAg的表达,并用RT-PCR检测肝组织HBV prec/c mRNA转录子的水平.结果 注射后第6天血清中,HBsAg、HBeAS在造模组中高表达.psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与对照组相比有显著差异(P<0.05),RT-PCR显示肝内HBV prec/c mRNA水平亦明显降低,而无关干扰对照组则无相应的干扰作用.结论 RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBeAS的表达,为乙型肝炎的治疗带来了新的希望.