人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3细胞系中的瞬时表达研究

目的：研究人胰岛素原基因在体外培养的NIH3T3中的瞬时表达情况。方法：采用脂质体转染法将携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）启动子－人胰岛素原基因的质粒转染到体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，转染后48h，用放射免疫分析方法（RIA）分别测定NIH3T3细胞内外的胰岛素水平。结果：NIH3T3细胞外的胰岛素水平于转染前后无显性变化（P＞0．05），而细胞内的胰岛素水平则于转染后明显升高（P＜0．05）。结论：转染后48h的人胰岛素原基因在NIH3T3细胞内有较高的胰岛素表达水平，使I型糖尿病的基因治疗成为可能。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应.方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况.将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数.结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系.MOI为100倍时,转染效率达95%.RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达.2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P＞0.05).转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P＜0.01).结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生.     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响

目的 探讨mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响.方法 运用电穿孔法将pcDNA3-mTOR质粒转染NIH3T3成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆,RT-PCR和Western印迹分析检测转染组和对照组细胞mTOR mRNA与蛋白的表达,MTT方法检测细胞增生.结果 转染组细胞mTOR mRNA和蛋白质的表达显著增强(P＜0.01);MTT法检测转染组光吸收值显著大于对照组(P＜0.01);结论 mTOR基因转染成纤维细胞可获稳定表达,并明显促进成纤维细胞增生.     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

腺病毒介导的Cbfa1基因转移对NIH3T3细胞的调节作用

目的探讨腺病毒介导的核心结合因子a1(core binding factor a1, Cbfa1)基因转移对NIH3T3细胞的调节作用.方法含有Cbfa1基因的重组腺病毒转染NIH3T3细胞,RT-PCR检测成骨标志基因骨钙素(osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen)、骨唾液蛋白(bone sialoprotein, Bsp)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)、Cbfa1的表达.Western blot检测Cbfa1的表达,免疫细胞化学染色检查OCN的表达.结果 NIH3T3细胞在Cbfa1基因转移后RT-PCR检测到OCN、Bsp、AKP、 type Ⅰ collagen基因的表达, Western blot检测到Cbfa1蛋白的表达,免疫细胞化学染色检测到了OCN蛋白的表达.结论腺病毒介导Cbfa1基因转移NIH3T3细胞后出现成骨表型.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

目的 通过基因转染方法，用骨形态发生蛋白3（BMP3）基因转染成纤维细胞（NIH－3T3细胞），观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化，初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径。方法 定向克地将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，观察不同时期被转染细胞的形态学变化，钙钴法染色转染细胞时相的碱性磷酸酶并作图像分析。结果 转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达。转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状，转染后2周细胞由长梭形变为多角形，转染后4周细胞变为多边形，类似成骨细胞，钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染色黑色的碱性磷酸酶颗粒，及图像分析及转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。结论 通过向NIH－3T3细胞内转染BMP3基因，可以使NIH－3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化，被转染细胞内碱性碱性磷酸酶水平明显增高，已具有成骨细胞某些特性。     

壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外表达的研究

目的研究壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外转染及表达。方法采用壳聚糖体外转染鼠成纤维细胞,对转染后72h的细胞应用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达。27只糖尿病大鼠随机分为3组(pCMV.INS组、pCMV组、生理盐水组),体内转染通过尾静脉注射糖尿病大鼠,检测空腹血糖和胰岛素。结果pCMV转染细胞无胰岛素表达,pCMV.INS转染大约10%的细胞有胰岛素表达;pCMV.INS转染大鼠血浆胰岛素显著高于生理盐水对照组(P<0.01)和pCMV对照组(P<0.01)。结论人胰岛素基因可通过壳聚糖直接转染至糖尿病大鼠体内发挥治疗作用及壳聚糖可能是一种很有前途的基因载体。     

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的 探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响.方法 将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆.用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性.结果 检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P＜0.01),转染细胞生长明显受抑.结论 canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的:探讨将HAb18G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/3T3的可行性及其意义.方法:将含有肝癌相关抗原HAb18G全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.0/HAb18G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况;RT-PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb18G刺激3T3细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的情况.结果:利用脂质体介导法将HAb18G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb18G的阳性克隆株;RT-PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平较未转染前增多;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强.结论:HAb18G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达,具有其独特的生物学意义.     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

Bioactivities of culture supernatants from retroviral packaging cells carrying the mouse Fas ligand gene

CD95 ( Fas) ,type transmembrane protein ofTNF and TGF receptor family,is expressed on hu-man multi- organ and some tumor cells besides acti-vated mature T cells and lymphocytes transfected byHTLV- 1 ,HIV and EBV. Fas L is a typical type transmembrane protein,belonging to TNF family.Cells expressing Fas L are limited to activated T cells,cornea and testiculartissues.Fas L is a specific ligandfor Fas antigen.Cross- linking of Fas by Fas L in-duces Fas cellsto undergo apoptosis[1,2 …     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-HsPDF。该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达。HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征。结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础。     

Construction of human insulin gene expression recombinant and its effect on blood glucose of diabetic rats

OBJECTIVE To study the effect of human insulin gene modified fibroblasts on blood glucose in diabetic rats.

METHODS An expression vector containing human insulin gene was constructed by recombinant DNA technique and introduced into fibroblast Ltk- cells by lipofectin-mediated DNA transfection. Following G418 screening, the survived cells were selected and enriched. Finally a cell line, PRI-12 was generated for the highest insulin production. Then, these cells were injected into streptozocin (STZ)-induced diabetic rats.

RESULTS Insulin DNA transfected Ltk- cells were able to express insulin at a high level in a long-term culture. Furthermore, these Ltk- transfectants could decrease blood glucose significantly (P < 0.01) and obviously increase the body weight (P < 0.01) when they were injected into STZ-induced diabetic rats.

CONCLUSIONS These results suggest that the cell lines transfected insulin gene could secrete insulin and execute effect on diabetic rats. The study provides support for the view that somatic cell gene therapy offers a potential approach to delivery insulin into diabetes mellitus.