成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏,为心脏先循环灌流无钙台氏液,后循环灌流酶液,酶解完成后取左心室,迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎,吹打数次后离心,去上清,温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min,梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%,复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状,横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞,能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。     

Wistar大鼠乳鼠与成年鼠心室肌细胞的分离与性质鉴定

目的 探索和优化稳定的适于电生理实验研究的乳鼠及成年大鼠心室肌细胞分离方法。方法 切碎乳鼠心室肌,胰蛋白酶消化,差速贴壁2 h纯化心室肌细胞,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,体外培养48 h后分别行倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化鉴定,微电极阵列记录细胞搏动频率和场电位。采用Langendorff灌流成年大鼠心脏,主动脉逆行插管,胶原酶域反复灌流消化约30 min,无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心室肌组织,台氏液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,将细胞悬液用逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,用于膜片钳记录。结果 经4 -6次消化后,乳鼠心室组织消化完全,细胞存活率大于80%。倒置显微镜下观察,细胞呈梭形、多角形。 12 h有少部分细胞搏动,48 h细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30 - 80次/分。 琢鄄辅肌动蛋白（琢鄄actin）经免疫组化检测,纯度达96%。 Langendorff灌流酶解法可获得形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整、立体感强的单个成年鼠心肌细胞,存活率85%,复钙后存活率50%,可用于膜片钳记录。结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的用于电生理检测的心室肌细胞。     

SD大鼠心肌细胞分离方法探索

目的:探索一种稳定、简单、成功率高的,分离成年SD大鼠心肌细胞的方法。方法:采用Langendorff灌流法及二步酶解法获取单个心肌细胞,并与四步法进行比较。结果:二步法可获得横纹清晰、立体感强的单个心肌细胞,初步存活率(79.1±2.9)%,复钙后存活率(46.8±2.8)%,分别显著高于四步法的[(75.2±4.2)%,(40.2±2.2)%,P均0.05]。与四步法相比,二步法酶解所需时间和平均试验成本明显减少[(40.2±3.3)min:(30.1±3.4)min,(115.2±5.7)元:(100.6±7.6)元,P均0.05]。结论:该法快捷、简单、经济、重复性好,为心肌细胞的电生理研究打下良好基础。     

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个,采用Langendorff灌流,行回旋支插管,正常台式液灌流10 s,使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流,同时结扎其他血管及分支,剪去其余心脏组织,待左房及左心耳充盈,无钙台氏液灌流5 min,125 U/ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30~45 min,后用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90%,形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。     

膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析

目的介绍一种膜片钳实验中简便、快速分离大鼠和豚鼠心肌细胞的方法,探讨影响细胞分离产量和质量的原因。方法迅速取出动物心脏,挂在Langendorff装置上,分别用无钙台式液和酶液进行灌流一段时间,然后剪取心室部分,置于KB液中将其剪碎吹打分散,筛网过滤将滤液放置在2℃～6℃冰箱中冷藏4h后可进行膜片钳实验。结果用此方法分离出的心肌细胞存活率高,结构完整,具有良好的耐钙性和较长的存活时间。结论控制好分离心肌细胞分离中的各种实验条件和熟练的实验操作,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化

目的:基于目前已有报道的心肌细胞体外消化及分离方法,对胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法进行系统探索和优化。方法:取胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心脏,运用不同方法分离心肌细胞。利用Count Star仪器检测心肌细胞大小及活性。取细胞悬液涂片,针对心肌细胞标志物α辅肌动蛋白(α-actinin)表达进行免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察心肌细胞形态。结果:用胰酶消化法分离胚胎期小鼠心肌细胞,获得存活率大于94%的心肌细胞。用心脏解离试剂盒法(Gentle MACS法)体外分离新生小鼠(出生后1～3 d)心肌细胞,获得存活率约为97%的心肌细胞。分别用Gentle MACS法、非Langendorff灌流法分离出生后4 d和7 d的小鼠心肌细胞,前者仅获得存活率为58%的心肌细胞,而后者获得的心肌细胞存活率为70%～80%。对于成年小鼠,非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法均可获得杆状率、存活率都在70%左右的心肌细胞。结论:结合文献以及本实验结果发现,分离胚胎期小鼠心肌细胞可用胰酶消化法;分离出生后1～3 d小鼠心肌细胞可用Gentle MACS法。对于出生后4 d和7 d的小鼠,非Langendorff灌流法可获得存活率及杆状率均较高的心肌细胞,分离成年小鼠心肌细胞则适合用非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法。     

灌流速度与新西兰兔心肌细胞急性分离的关系(英文)

目的:建立一种简单,稳定,成功率高的新西兰兔心肌细胞分离方法。方法:比较分离细胞过程中Langen-dorff灌流装置的灌流速度[50r/min(8ml/min)和65r/min(11ml/min)]对细胞分离的影响。结果:与灌流速度为50r/min时比较,灌流速度为65r/min获得细胞所需时间[(33±9.10)min比(19.29±2.73)min]明显缩短,成功率(50%比91%)、存活率[(38.26±2.63)%比(85.71±2.21)%]明显提高(P均<0.01)。结论:灌流速度是影响新西兰兔心肌细胞急性分离的重要因素,65r/min灌流速度能更稳定、成功获取单个心肌细胞。     

正常耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离方法及体会

目的探讨稳定分离用于膜片钳实验的耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞的方法。方法在自制心脏灌流装置上,采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,以膜片钳全细胞方式记录离子流。结果在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞。结论在心肌细胞分离过程中如严格按照本文的介绍,能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞。     

改良成年小鼠心室肌细胞分离方法

目的 小鼠是优良的背景基因动物,分离成体原代心肌细胞可以真实地从细胞和分子水平反映单个心室肌细胞的功能。小鼠心室肌细胞的分离和大鼠相比较困难,分离获得的细胞存活率较低,为提高小鼠心室肌细胞的成活率和收获量,本研究团队通过艰苦的摸索,改进了小鼠成体心肌细胞的分离方法。方法 该方法采用心脏在体主动脉插管,行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置,用胶原酶液II灌流、消化心脏后,将心脏剪碎并用吸管吹打,经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞。本研究检测并对比了在体和离体主动脉插管获得的心肌细胞的状态：梯度复钙后,在倒置显微镜下观察细胞的形态和杆状心室肌细胞的数目。结果 研究结果显示：改良的主动脉逆行灌流法在缩短手术时间的同时,提高了小鼠心室肌细胞收获量和存活率。本课题组利用医用三通管,独创倒置灌流排气法,可以迅速排空灌流装置中的气体;利用注射器和灌流针结合,独创前加压灌流法,可以快速彻底地冲洗心脏中的血液;并采用实验室常规眼科镊和血管钳巧妙组合成协助装置,可以单人独立完成插管,不需要助手协助,节约人力,节省经费开支。结论 这一方法的改进使整个实验流程简化,缩短了实验时间,操作简便易学;同时该分离方法稳定、可靠、有效,可以为同类型实验提供思路和借鉴。     

腺病毒过表达TNNI3K基因对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度的影响

目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad.GFP病毒和Ad.TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。     

缝隙连接对双细胞动作电位的影响

为探讨双细胞水平缝隙连接(GJ)对动作电位时程(APD)的影响,本实验用酶解法分离得到兔左室内膜心肌细胞,分为单细胞组及双细胞组,分别进行两个实验:①先用正常台氏液,续用含索他洛尔的正常台氏液灌流;②先用含索他洛尔,续用含索他洛尔+甘珀酸钠(GJ失耦联剂)的正常台氏液灌流。用β-escin穿孔膜片技术记录APD。结果:①正常状态下,单细胞组的APD大于双细胞组(688±89msvs666±77ms,P>0.05);索他洛尔灌流后,两组细胞APD均延长,单细胞组APD延长的程度明显大于双细胞组(305±66msvs168±51ms,P<0.01);②先予索他洛尔预灌流,再用索他洛尔加GJ失耦联剂———甘珀酸钠灌流,两组APD均延长,双细胞组APD延长的程度明显大于单细胞组(181±64msvs28±13ms,P<0.01)。结论:GJ可以对抗病理情况下APD的延长。     

不同周龄大鼠心肌细胞收缩/舒张功能的研究

目的研究不同周龄对大鼠心肌细胞收缩/舒张功能的影响。方法SD大鼠分为三个周龄组:A组(12~15周)、B组(36~41周)和C组(51~55周),并以常规酶解法分离成年大鼠心肌细胞,观察分离即刻(D时间点)、复钙1h后(E时间点)和电刺激10min后(F时间点)心肌细胞成活率,采用IonOptix单细胞动缘探测系统同步检测心肌细胞的收缩幅度、收缩/舒张速度和钙瞬变等,这些指标均由计算机自动实时采集并记录。结果复钙1h后和电刺激10min后心肌细胞成活率降低均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),周龄越大越明显,随着周龄的增大,心肌细胞收缩幅度(峰值高度,ph)、心肌细胞收缩幅度/单个心肌细胞的长度百分比(ph/bl%)、最大收缩速率(maxi mal velocity of contraction, dL/dt)、最大舒张速率(maxi mal velocity of relaxation,-dL/dt)和钙瞬变幅度(FFI)降低,ph在A组、B组和C组分别为(0.14±0.06),(0.12±0.05),(0.11±0.05)μm;ph/bl%分别为(9.17±3.54)%、(7.14±2.58)%和(6.56±2.36)%; dL/dt分别为(2.01±0.74),(1.82±0.51),(1.51±0.56)μm/s;-dL/dt分别为(2.10±0.75),(1.70±0.62),(1.41±0.52)μm/s;FFI分别为(0.38±0.05),(0.35±0.04),(0.25±0.05)。其中C组ph/bl%、 dL/dt、-dL/dt和FFI均较A组显著降低(P<0.05),降低幅度分别为27%,26%,33%和31%。结论随着周龄的增大,分离大鼠心肌细胞的成活率下降,大鼠心肌细胞的收缩/舒张功能降低,钙瞬变幅度减小。     

Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定

目的 探讨Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定方法.方法 采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,然后采用胞内钙荧光测定技术测定细胞内钙离子浓度.结果 在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞.采用荧光探针Fura-2/AM,可准确测定细胞内钙离子浓度.结论 通过本研究采用的方法,不仅可获得大量耐钙心肌细胞,而且可准确测定细胞内钙离子浓度.     

微电极阵芯片技术在心肌电生理研究中应用的可行性

目的探讨60极微电极阵芯片(MEA)技术在整体心脏、心肌组织片和培养心肌等电生理研究中的应用。方法①80只豚鼠,开胸取心脏并以2.5ml/min速度Langendorff灌流心脏20min,信号稳定后采样;②60只SD大鼠,开胸取心,剪取5mm×5mm大小的心脏组织片,置于MEA盘,台氏液间歇灌流5min,用5μV×1ms的刺激脉冲连续刺激,刺激间隔为1s,比较心房和心室组织片场电位(FPs)形态和传导时间;③20窝出生后3天以内的昆明小白鼠,消化分离心肌细胞,培养于MEA盘内,进行组织信号采样。结果①大鼠整体心脏灌流30～90min内能够记录到稳定的自主节律下的FPs信号,心室肌场电位时程(FPdur)210±78ms;心房肌FPdur164±58ms;房室传导时间320±150ms;并能记录到FPs激动顺序图。②心肌组织靶点取样,台氏液间歇灌流和电刺激下,组织的兴奋性可以稳定保持2h。心室肌组织片FPdur115.80±11.61ms,心房组织片FPdur83.71±6.48ms,刺激信号在心房组织片的传导时间66.46±6.73ms,心室组织片传导时间47.40±5.62ms;③小鼠乳鼠心脏原代培养心肌24h时后开始有散在、不同步的细胞克隆搏动和点状FPs信号,72h后细胞融合,开始记录到基本同步的群动和多位点FPs信号,培养心肌自发搏动频率150±100次/分。结论 MEA技术可以稳定记录小动物整体灌流心脏,心脏定点取样组织片,培养心肌细胞60极场电位和电传导特性。     

成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性

目的 :摸索成年小鼠心肌细胞分离方法并观察其电生理特性。方法 :采用酶消化法分离单个心肌细胞 ,应用膜片钳全细胞记录技术记录钙电流和钾电流。结果 :本法分离所得心肌细胞横纹清晰 ,一次性复钙 ,可获得 5 0 %～6 0 %的耐钙细胞 ;并具有正常电生理活性 ,易于形成高阻封接 ,可用于钙电流和钾电流记录。结论 :本实验所采用的分离方法经济、简便、成功率高 ,所获细胞具有正常的电生理活性     

钙调蛋白激酶Ⅱ抑制剂对肥厚心肌细胞早期后除极的影响

目的:探讨钙调蛋白激酶Ⅱ特异性抑制剂KN-93对肥厚心肌细胞动作电位时程(APD)及早期后除极(EAD)发生率的影响。方法:选取雌性新西兰大白兔,通过缩窄腹主动脉制备兔心肌肥厚模型(LVH组),并设假手术组(sham组)作对照比较,仅游离腹主动脉,未进行缩窄。8周后,应用超声心动图观察左心室肥厚程度。采用胶原酶消化法分离单个心肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录动作电位(AP),分别给予低钾(2mmol/L)、低镁(0.25mmol/L)台氏液灌流(sham组、LVH组)、含KN-92(KN-92组)、KN-93(KN-93组)的低钾、低镁台氏液灌流,观察慢频率电刺激(0.25～0.5Hz)条件下各组心肌细胞EAD的发生率,同时观察KN-92、KN-93对肥厚心肌细胞APD的影响。结果:8周后,与Sham组相比,心肌肥厚组的心脏外形明显增大,左室壁明显增厚,模型建立成功。电流钳模式下记录动作电位,在低钾、低镁台氏液灌流及慢频率电刺激下,Sham组、LVH组、KN-92组(0.5μmol/L)及KN-93组(0.5μmol/L)EAD的发生率分别为0/12、11/12、10/12和5/12。当KN-92组及KN-93组中药物浓度增至1μmol/L时,肥厚心肌细胞EAD的发生率分别为10/12和2/12,同时其对APD无明显影响(P>0.05)。结论:钙调蛋白激酶Ⅱ特异性抑制剂KN-93能够有效抑制肥厚心肌EAD的发生,这可能是其抗肥厚心肌室性心律失常发生的主要作用机制。     

兔心室肌细胞的急性分离及电生理记录

目的建立一种简单、稳定的兔心室肌细胞分离方法并进行多种电生理记录。方法采用Langendorff灌流装置及急性酶解分离技术获取单个兔心室肌细胞,并利用全细胞膜片钳技术记录动作电位及多种膜电流。结果耐钙心室肌细胞的存活率在50%～60%,其静息膜电位在-80～90mV,并成功地记录到典型的动作电位及钾、钠、钙等电流。结论该方法简便、稳定,细胞存活率高且易于进行各种电生理实验。     

神经调节蛋白-1对小鼠心室肌细胞L型钙电流的影响

目的观察神经调节蛋白-1(NRG-1)对大鼠心室肌细胞L型钙电流(ICa-L)的影响。方法 C57小鼠取其心脏,经主动脉逆行插管后行Langendorff灌流,以酶解法分离获得单个心室肌细胞,采用全细胞膜片钳技术,记录NRG-1对L型钙电流(ICa-L)的影响。结果 0.05,0.1,0.2μmol/L NRG-1对ICa-L峰电流的抑制率分别为15.3%±2.2%,32.0%±4.7%,52.6%±6.1%(n=6,P0.05),并使电流-电压曲线上移,激活延迟,失活后恢复时间延长。结论 NRG-1通过延迟钙通道的激活,延长失活后恢复时间,抑制心肌细胞ICa-L。     

中枢交感神经活性抑制对老年大鼠心肌细胞收缩功能的影响

目的探讨中枢交感神经活性抑制对老年大鼠心功能、单个心室肌细胞收缩幅度和细胞存活率的影响。方法选择月龄>18个月的SD大鼠30只,随机分为老年可乐定组和老年对照组,每组15只,另选4~6月龄的SD大鼠18只为成年组,老年可乐定组大鼠以可乐定腹腔注射2周,其他2组用生理盐水腹腔注射2周,进行血流动力学参数测定,酶分离大鼠心肌细胞,用含不同浓度钙离子或异丙肾上腺素(ISO)的KH液对心肌细胞进行表面灌流,观察心肌细胞的收缩幅度,计算其存活率。结果与成年组大鼠比较,老年对照组左心室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)降低,左心室舒张末压(LVEDP)升高,且心肌细胞在不同浓度钙离子或ISO刺激下收缩幅度较成年组降低(P<0.05)。老年可乐定组大鼠±dp/dtmax改善,LVEDP降低,心肌细胞在同等条件刺激下收缩幅度较老年对照组增加(P<0.05);3组大鼠间细胞存活率无统计学差异(P>0.05)。结论抑制中枢交感神经紧张性可改善老年大鼠心功能,增加心肌细胞的收缩幅度。     

ERK1/2信号通路介导心肌营养素1对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的探讨心肌营养素1对心肌缺氧复氧损伤的保护作用及其信号通路。方法用改良的方法培养出生1～3天的乳鼠心肌细胞,分为五组:对照组、缺氧复氧组、缺氧复氧+心肌营养素1组、缺氧复氧+心肌营养素1+PD98059(ERK阻断剂)组及缺氧复氧+心肌营养素1+DMSO组。缺氧3 h,复氧3 h。MTS法测定心肌细胞存活率,四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物(JC1)检测心肌细胞线粒体膜电位,二氯荧光磺双乙酸盐(DCFH-CA)检测细胞活性氧水平,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR检测心肌细胞促凋亡基因Bad mRNA表达,Western blot检测ERK1/2蛋白水平。结果缺氧复氧后心肌细胞凋亡率及细胞内活性氧水平较对照组明显增加,分别是19.4%±2.3%比2.2%±0.2%及14.28±1.42比3.54±0.46(P<0.05),而心肌细胞存活率显著降低,心肌细胞线粒体膜电位下降。而心肌营养素1处理后,心肌细胞存活率明显高于缺氧复氧组,心肌细胞凋亡率及细胞内活性氧水平显著减少,心肌细胞线粒体膜电位更高,ERK1/2磷酸化蛋白水平增加,Bad mRNA表达明显下调。心肌营养素1的这种作用能被ERK阻断剂PD9...