Nnat基因在大鼠脑发育过程中表达的初步研究

目的:观察Nnat基因在大鼠脑发育过程中基因表达的变化规律,藉以探讨Nnat在神经系统发育过程中的作用。方法:采用半定量RT-PCR法分析出生前后大鼠脑内Nnat表达水平的变化,Western blot检测Nnat蛋白的表达。结果:在大鼠胚胎第9 d(E9)脑内Nnat mRNA开始表达,但表达量较低,以后其表达量逐渐升高,出生前有轻微下调。出生后大鼠的不同脑区Nnat mRNA的表达量都呈现下降趋势,60 d时达到较低的水平。Nnat蛋白在不同脑区都具有表达,但不同亚型蛋白量的相对比例不同。结论:Nnat基因在胚胎期及出生后大鼠脑内的表达量与中枢神经系统发育及分化过程的时间上有一定的同步性,提示Nnat的作用可能与神经元分化的调节有关。     

非小细胞肺癌中窖蛋白1基因的蛋白表达和甲基化及其意义

目的 检测窖蛋白1(Car-1)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的蛋白表达以及启动子的甲基化状况,探讨Cav-1基因在NSCLC中的作用及其临床意义.方法 应用免疫组织化学(sP法)和量子点Qd600染色检测123例NSCLC组织、17例良性病变肺组织中Cav一1蛋白表达和亚细胞定位.亚硫酸氢钠处理DNA,甲基化特异性PCR(MSP)检测Cav-1基因启动子区域的甲基化水平.结果 Cav-1蛋白在肺支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞的胞质和胞膜高表达.癌旁组织(对照)组和肺癌组中Cav-1蛋白的阳性率分别为17/17、43.1%(53/123),两组间差异有统计学意义(P=0.001);Cav-1蛋白在NSCLC不同的组织学类型(P=0.552)和分化程度(P=0.160)中差异均无统计学意义.Cav-1蛋白阳性率与NSCLC的TNM分期(P=0.001)以及淋巴结转移(P=0.001)均相关.在40例Cav-1蛋白表达为阴性的肺癌组织和12例癌旁肺组织,MSP法均未检测到Cav-1因启动子区域的甲基化.结论 Cav-1蛋白失表达的机制可能与启动子区是否甲基化无关.Cav-1蛋白高表达预示NSCLC恶化进展和高侵袭性.     

Pax-6在大鼠发育脑喙侧神经干细胞迁移流中的表达

目的 了解大鼠脑发育过程中，喙侧神经干细胞迁移流中不同时期Pax-6表达水平的时空差异。方法 用BrdU对胚胎14d、出生后0、1和7d的Wistar大鼠行活体标记，取各时相点鼠脑，冰冻切片，行BrdU、Nestin、Pax-6和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色，观察Pax-6在脑内增殖细胞中的表达情况，比较在上述4个时相点，Pax-6于室管膜前下区、迁移流主干部分和嗅球3个部分的表达差异。结果 1．在发育中大鼠脑内，Pax-6主要表达于神经干细胞内，在海马增殖细胞亦有较高表达。2．在喙侧神经干细胞迁移流内，Pax-6在迁移流主干部分的表达高于室管膜前下区和嗅球；在胚胎14d的表达与出生后0d和1d相似，表达水平较高，出生后7d迅速下降到很低水平。结论 在大鼠脑发育过程中，Pax-6主要表达于神经干细胞及海马增殖性细胞内，在大鼠出生后，随着大鼠脑的发育，Pax-6于喙侧神经干细胞迁移流的表达迅速减弱，但迁移流主干部分的表达始终高于室管膜前下区和嗅球。     

铁调素在小鼠脑内的表达及其对膜铁转运蛋白1和二价金属离子转运体1表达的影响

目的 探讨铁调素(hepcidin)在小鼠脑内的表达及其对膜铁转运蛋白1(ferroportir 1)和二价金属离子转运体1(DMT1)表达的调节作用.方法 应用RT-PCR技术检测铁调素在正常小鼠各脑区的表达分布,并观察了脑室内注射铁调素对DMT1、膜铁转运蛋白1表达的影响 结果 铁调素在小鼠脑内有广泛表达,且不同脑区表达程度不同,脉络丛部分表达较高.结论 侧脑室内注射铁调素后,能够显著影响DMT1、膜铁转运蛋白1表达,且具有明显的区域特异性.     

miR-29和ZO-1在大鼠血神经屏障中的作用研究

目的:观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt PA)通过miR-29对大鼠外周神经闭锁小带蛋白-1(ZO-1表达水平的影响。方法:健康雌性SD大鼠随机分为对照组(Control)、rt PA组(rt PA)和无催化活性rt PAi组(rt PAi)。3组大鼠分别在坐骨神经旁注射生理盐水、rt PA和rt PAi,2 h后利用real time RT-PCR、Western Blot及免疫荧光方法检测坐骨神经内ZO-1的mRNA和蛋白表达水平变化,并采用real time RT-PCR方法检测坐骨神经miR-29的表达水平。结果:与对照组相比,rt PA组大鼠坐骨神经周围注射rt PA后,ZO-1的mRNA表达下降(P 0. 05),Western Blot发现ZO-1蛋白表达水平下降(P 0. 05),免疫荧光检测同样发现ZO-1表达减少;无催化活性的rt PAi处理大鼠坐骨神经后,神经束膜内ZO-1的mRNA及蛋白水平同样明显下降(P 0. 05);与对照组相比,rt PA和rt PAi处理2 h后大鼠坐骨神经内miR-29表达均明显增高(P 0. 05)。结论:rt PA通过减少神经束膜中ZO-1表达水平,增加神经束膜通透性,其作用不依赖于其对凝血酶原复合物的催化功能,可能通过增加miR-29表达下调ZO-1蛋白表达水平。     

海洛因成瘾、戒断、脱毒对大鼠前额叶皮质GDNF和p75NTR表达的影响

目的:研究大鼠海洛因成瘾、戒断、脱毒治疗期间,前额叶皮质(PFC)脑区中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养因子受体p75(p75NTR)的表达变化。方法:正常雄性SD大鼠32只,随机分为海洛因处理组(n=24)和对照组(n=8),海洛因处理组又分为海洛因成瘾组(HDG)、纳洛酮戒断组(HWG)、美沙酮脱毒治疗组(MDG)。各组大鼠取PFC脑区,采用免疫组织化学技术、Western Blot检测及图像分析方法研究GDNF和p75NTR阳性细胞的反应和蛋白表达情况。结果:(1)免疫组化结果显示:与对照组相比较,成瘾组中GDNF、p75NTR阳性细胞免疫反应明显减弱,平均光密度明显降低(P 0. 05),纳洛酮戒断之后GDNF、p75NTR阳性细胞免疫反应强度显著增强,平均光密度增强(P 0. 05)。(2) Western Blot结果显示:GDNF、p75NTR蛋白表达水平在海洛因成瘾大鼠PFC脑区显著降低(P 0. 05);经纳洛酮戒断和美沙酮脱毒治疗后GDNF、p75NTR蛋白表达水明显有所升高(P 0. 05)。结论:在海洛因成瘾、戒断、脱毒过程当中,GDNF和p75NTR的变化趋势大致相同,二者均有负性调节作用。     

大鼠海马脑区脑源性神经营养因子慢病毒注射与表达的检测

目的:建立成年大鼠海马脑区注射脑源性神经营养因子(BDNF)慢病毒表达载体的方法,并检测BDNF慢病毒载体体内表达目的基因的能力.方法:健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(SH)、生理盐水组(NS)、GFP慢病毒注射组(GFP)和BDNF慢病毒注射组(BDNF),每组15只.所有实验大鼠在脑立体定位仪下定位海马组织.NS、GFP和BDNF组分别给予盐水(2μL)、GFP慢病毒(2μL)和BDNF慢病毒(2μL),SH组只实行手术操作.注射手术7d、14d和30d后,分别处死大鼠并进行在冰上取各组大鼠海马组织,分别提取海马总RNA和总蛋白质通过RT-PCR和Westernblot检测各组大鼠海马组织BDNFmRNA和蛋白表达水平的变化.同时通过原位杂交方法检测BDNF的表达水平和脑区分布.结果: BDNF慢病毒注射成年大鼠7d、14d和30d后,均可以成功检测到BDNF在mRNA和蛋白水平在海马脑区都有明显的表达,同假手术组相比具有显著性差异;原位杂交检测显示BDNF慢病毒注射成年大鼠海马脑区7d、14d和30d的BDNF表达水平和脑区分布均保持稳定.结论:成功地建立了BDNF慢病毒注射成年大鼠海马脑区的方法,并可在注射后不同时间段检测到BDNF高水平的表达和均匀的海马脑区分布,为进一步将其应用于神经系统损伤性疾病的治疗奠定了基础.     

乳腺癌中Caveolin-1蛋白的表达及临床意义

目的 观察窖蛋白(Caveolin-1,Cav-1)在正常乳腺组织、良性增生性乳腺病及乳腺癌中的表达及其与乳腺癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组化SP法检测10例正常乳腺组织、15例良性增生性乳腺病和48例乳腺癌组织中Cav-1的表达,分析Cav-1在不同乳腺病变中表达的差异.结果 Cav-1在正常乳腺组织、良性增生性乳腺病及乳腺癌中的阳性率分别为40%、46%和100%,平均表达强度积分(±s)分别为0.90±0.83、0.93±1.16和6.24±2.18.其在正常乳腺组织与良性增生性乳腺病之间表达差异无统计学意义(P>0.05);在正常乳腺组织、良性增生性乳腺病与乳腺癌之间表达差异具有显著性(P<0.01);在乳腺癌不同组织学类型、病理分级、临床分期、细胞增殖指数(MIB-1/Ki-67)和有无淋巴结转移中阳性率和表达强度差异均无显著性(P>0.05).结论 Cav-1在正常乳腺组织及良性增生性乳腺病中呈低表达,在乳腺癌中呈高表达,表明Cav-1与乳腺癌的发生密切相关,但与乳腺癌的组织学类型、病理分级、临床分期、有无淋巴结转移和细胞增殖指数(MIB-1/Ki-67)无明显相关性.     

小凹蛋白-1下调人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流的作用机制

 目的：研究小凹蛋白-1(Cav-1) 对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞外钙敏感受体(CaR)介导钙内流的作用机制。方法：取2~3代HUVECs,采用细胞膜穴样凹陷(caveolae)结构破坏剂非律平（filipin）和甲基-β-环糊精(MβCD)及Cav-1基因沉默,配合CaR激动剂精胺（spermine）和负性变构调节剂Calhex 231。Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2+浓度(［Ca2+］i)。Western blotting检测HUVECs中Cav-1以及CaR蛋白表达,免疫共沉淀技术检测Cav-1和CaR相互作用。用蔗糖密度梯度离心的方法提取并鉴定caveolae,Western blotting检测caveolae的标志蛋白Cav-1和浮舰蛋白1（flotillin-1）及CaR表达。 同时检测胞膜、胞浆和高尔基体标志蛋白：转铁蛋白受体(TfR)、β-肌动蛋白（β-actin）和β-外被体蛋白（β-COP）。检测富含Cav-1膜(CEM)区、非caveolae I区 (NCF I)和II区(NCF II)的Cav-1和CaR表达。结果：（1）细胞外液为含钙液时,Calhex 231完全阻断精胺刺激引起的［Ca2+］i升高(P<0.05),MβCD 可加强精胺升高［Ca2+］i的作用(P<0.05)。不同浓度MβCD 处理后各组Cav-1和CaR相互作用的差异无统计学意义(P>0.05);（2）免疫共沉淀结果显示,各组Cav-1和CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05);（3）与control组比较,spermine+Ca2+组 、filipin+spermine+ Ca2+组和 MβCD+spermine+Ca2+组CEM区的 Cav-1和CaR蛋白表达均降低(P<0.05), NCF I区的 Cav-1和CaR蛋白表达增加(P<0.05),NCF II 区Cav-1蛋白表达增加(P<0.05),而CaR蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在HUVECs中,Cav-1和CaR共定位于同一caveolae区,同时Cav-1对CaR介导的Ca2+内流有下调作用,其机制可能与Cav-1抑制CaR膜定位、促使其向非caveolae区转位及减弱其对激动剂的反应性有关。     

Caveolae在高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质合成中的作用

 目的：探讨胞膜小凹(caveolae)在高糖(HG)诱导大鼠肾小球系膜细胞(MCs)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达过程中的作用。方法：传代培养的大鼠MCs同步化后分为：(1)正常糖组;(2)HG组;(3)HG+甲基-β-环糊精(β-MCD)组;(4)HG+β-MCD+胆固醇组。用Western blotting检测小凹蛋白1(Cav-1)、磷酸化小凹蛋白1(p-Cav-1-Y14)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白的表达水平,用实时定量PCR检测细胞中Cav-1 mRNA表达变化,用ELISA方法检测上清中纤维连接蛋白(FN)的蛋白含量。结果： (1)高糖状态下, 系膜细胞 FN和ColⅠ 蛋白表达水平均显著增加(均P<0.05)。(2)高糖培养显著增加p-Cav-1-Y14水平(P<0.01),而对Cav-1 mRNA及蛋白表达无明显影响(P>0.05)。(3)β-MCD预处理抑制了高糖诱导的 p-Cav-1-Y14升高(P<0.01)及FN表达(P<0.05),但对高糖诱导的Col I表达无影响;β-MCD的作用可被胆固醇抑制。结论：高糖可显著增加系膜细胞1型胶原及纤维连接蛋白的合成。高糖诱导的纤维连接蛋白合成与Cav-1磷酸化水平增加有关。