胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景：软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复。目的：观察胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2联合应用对组织工程软骨形成的影响。方法：用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109L-1的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200μg/L胰岛素样生长因子1和（或）1μg/L转化生长因子β2进行立体培养。于培养的第3,5,7,9,11,13天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况。培养2周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色（AB-PAS）及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色。结果与结论：细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1和转化生长因子β2均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用。     

胰岛素样生长因子1与转化生长因子β2促进组织工程软骨构建的体外实验

背景:软骨组织的再生能力差,软骨组织工程能利用较少的细胞、支架材料和细胞因子对缺损进行修复.目的:观察胰岛素样生长因子1 与转化生长因子β2 联合应用对组织工程软骨形成的影响.方法:用酶消化法获取人软骨细胞,将培养的细胞以4×109 L-1 的细胞浓度接种在藻酸钙凝珠支架上,分别加入200 μg/L 胰岛素样生长因子1 和(或)1 μg/L 转化生长因子β2 进行立体培养.于培养的第3,5,7,9,1,13 天,进行细胞计数,观察软骨细胞的增殖情况.培养2 周后,进行大体形态观察和阿尔新蓝-过碘酸雪夫氏染色(AB-PAS)及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.结果与结论:细胞计数及免疫组织化学染色显示,胰岛素样生长因子1 和转化生长因子β2 均能促进软骨细胞增殖和软骨相关基质黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,其中胰岛素样生长因子1 的作用主要体现在促细胞增殖方面,而转化生长因子β2 的作用主要体现在促进软骨相关基质形成方面,二者联合应用具有促进组织工程软骨形成的协同作用.     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.     

人胰岛素样生长因子-1基因转染对软骨细胞增殖的影响

背景：各种生长因子对体外培养的软骨细胞均有不同程度的促增值作用，但半衰期较短，很难达到软骨缺陷治疗所要求的时效。目的：探讨自行构建携带人胰岛素样生长因子腺病毒载体(Ad／CMV-hIGF-1)对软骨细胞增殖的影响。设计：设立对照的实验研究。地点和对象：实验在中山大学林百欣医学研究中心进行。体外培养人胚胎软骨细胞，采用对数增长期的第3代软骨细胞进行实验。干预：自行构建携带MGF-1基因的重组腺病毒并进行PCR，Western blot鉴定。采用1，10，100及500不同感染复数单位(multiphcity of infection，MOI)的Ad／CMV-hIGF-1分别转染第3代软骨细胞，用磷酸盐(PBS)做阴性对照，MGF-1生长因子(100μg／L)做阳性对照。主要观察指标：采用四氮甲基唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测不同时间、不同组别软骨细胞吸光度。结果：第2代重组腺病毒上清液中PCR鉴定含有hIGF-1基因，Western blot证实Ad／CMV-hIGE-1表达成熟的hIGF-1生长因子。不同病毒滴度转染对软骨细胞增殖的影响存在量效依赖关系，在1～100 MOI之间，软骨细胞吸光度随着病毒滴度增加逐渐升高，100 MOI软骨细胞吸光度约为PBS组的3倍；500 MOI Ad／CMV-MGF-1时，软骨细胞吸光度较100 MOI下降，与1 MOI与10 MOI对软骨细胞增殖的影响近似。PBS组随着细胞体外培养时间延长，细胞增殖下降，MGF-1生长因子、hIGF-1基因对软骨细胞增殖的影响存在时效关系，72h达到峰值。结论：成功构建Ad／CMV-hIGF-1；Ad／CMV-MGF-1基因转染对软骨细胞增殖的影响存在量效、时效依赖关系。     

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景：人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的：验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法：构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论：测序及酶切证实真核表达载体plRES2-EGFP-hlGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为（16±3）％。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22．65υg／L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。     

软骨形态发生蛋白1诱导仔鼠脂肪干细胞裸鼠体内软骨的分化

背景:脂肪干细胞在特定的培养条件下可向软骨细胞分化,软骨形态发生蛋白1是重要的调节软骨细胞分化的生长因子.前期实验已证实了软骨形态发生蛋白1诱导大鼠脂肪干细胞体外可向软骨细胞形态分化,但是能否在体内成软骨呢?目的:验证应用软骨形态发生蛋白1体外诱导SD仔鼠脂肪干细胞,复合自制牛松质骨支架材料植于裸鼠皮下成软骨情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-11/2008-05在解放军第四军医大学基础部实验动物中心、解放军第四军医大学西京医院全军骨科实验研究所完成.材料:7 d龄SD仔鼠16只用于分离培养脂肪下细胞及软骨细胞,20只成年裸小鼠用于进行体内埋植实验,雌雄不限.方法:体外培养的脂肪干细胞复合于支架上,加入诱导液(基础培养液+50 μg/L软骨形态发生蛋白1)继续培养2周作为实验组:将SD仔鼠软骨细胞复合于支架上,常规培养2周作为对照组.20只裸小鼠,左侧腋窝皮下均植入实验组细胞-支架复合物,右侧腋窝皮下均植入对照组细胞-支架复合物.8,12周各处死10只,行甲苯胺蓝和番红O-固绿染色.主要观察指标:①细胞形态变化及扫描电镜观察细胞-支架复合物.②四甲基偶氮唑盐法测定实验组和对照组细胞各代的增殖情况.③裸小鼠体内埋植实验结果.结果:扫描电镜示,软骨细胞和经软骨形态发生蛋白1诱导的脂肪干细胞在自制牛松质骨支架上均生长良好,平均孔径约为382 μ m.经软骨形态发生蛋白1诱导的第2,3,4,5,6代脂肪干细胞(诱导组)生长良好并保持持续增殖趋势;对照组的软骨细胞从第4代开始生长缓慢.裸小鼠体内埋植12周时,番红O-固绿染色:实验组阳性,细胞呈球形,可见软骨陷窝;对照组阴性,细胞呈梭形.但两组支架都已降解.结论:软骨形态发生蛋白1体外诱导SD仔鼠脂肪干细胞,复合自制牛松质骨支架,裸鼠体内可成软骨.     

构建含人胰岛素样生长因子基因腺病毒载体及在兔骨髓间充质干细胞的表达

背景:Adeasy腺病毒系统是由T.C.He等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统.相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法,其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒,从而简化了腺病毒的构建和测试流程,而且,它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪,从而在近年来被广泛用作基因转染的载体.目的:用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达.设计:重复测量实验.单位:重庆医科大学儿科研究所.方法:实验于2004-11/2005-03在重庆医科大学儿科研究所完成.①重组腺病毒载体的构建:从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1,按Ad-easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0,电穿孔转化感受态XL-1细菌,扩增后获得重组腺病毒质粒,去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞;②腺病毒包装及扩增:Pae Ⅰ酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0,纯化后转染HEK293细胞,观察GFP的表达,待细胞90%以上漂浮后,冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad-hIGF-1(重组目的腺病毒)和Ad-0(重组空白腺病毒),将收集病毒上清重复多次感染293细胞(乒乓交互感染)以提高病毒滴度.③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5%CO2孵箱培养,隔天换液,10 d细胞融合达70%～80%,贴壁紧密,细胞形态均一,呈典型的涡漩状排列,传代至第3代按病毒感染复数分组转染.主要观察指标:①腺病毒载体的构建及鉴定.②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度.③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达.结果:①重组腺病毒的鉴定:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约400 bp大小的清晰条带,与预期相符;pMDl8-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%(281位碱基同义突变,未影响氨基酸翻译:ggffggc-Gly);pAdtraek-CMV空载体和pAdtraek-MGF-1分别双酶切(Kpn Ⅰ和HindⅢ)鉴定正确.质粒pAdEasey-1和Ad-hIGF-1用Pac I酶切鉴定鉴定正确.证实病毒质粒同源重组成功.②荧光表达及滴度测定:重组质粒pAd-hIGF-1经Pac Ⅰ线性化后转化HEK293E细胞,48 h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达,72h表达最强.约5-7 d后细胞出现病毒感染的特征性CPE,由此计算出腺病毒滴度为3.0× 109 pfu/mL.⑨靶细胞的感染及表达效率:病毒转染骨髓问充质干细胞24 h后观察到绿色荧光的表达,72 h左右荧光达到最强.免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现.SDSPAGE电泳在7.8 KD附近出现明显条带,与实际人胰岛素样生长因子-1分子量7.6 kD相符,证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达.结论:本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hlGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-MGF-1,免疫细胞化学和Western Blot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达.     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景:以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养,诱导方式主要集中于细胞因子的方法,而椎间盘体内微环境,除细胞因子对细胞影响外,在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究.目的:在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导,观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异.方法:分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞,脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后,按5×106个细胞制成微球,置于Transwell培养板中培养,分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导;于诱导前、诱导7,14 d,观察细胞形态变化,并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定.结果与结论:在体外诱导7,14 d,两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别.RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达,但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强;诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高,优于转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组.结果表明,在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子,说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外,尚存在相互促进增殖分化作用.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor, hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞.方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成.根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达.结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达.结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的：构建增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced-green fluorescent protein，EGFP）标记的人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor，hIGF-1）真核表达载体，转染至兔骨髓间充质干细胞，为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法：实验于2005—03／2006—01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物，从质粒pcDNA3．1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1，亚克隆至pMD-T18载体，测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中，构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞，通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果：成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1，并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论：新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法，经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。     

应用纳米晶胶原基骨体外构建组织工程骨

目的:应用组织工程技术,建立体外诱导人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养的人工骨模型,探求细胞与纳米晶胶原基骨结合的最佳模式。方法:实验于2005-09/2006-09在江苏大学医学技术学院中心实验室完成。①实验材料:纳米晶胶原基骨材料由清华大学材料系崔福斋等人研制。骨髓取自骨科取髂骨患者(男性,30岁,患者知情同意)。②实验干预:全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞并扩增,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化。取纳米晶胶原基骨材料经60Co照射灭菌,无水乙醇疏水化,三蒸水洗去乙醇等处理制备支架材料。细胞与支架材料复合培养。③实验分组:骨髓间充质干细胞培养至第3代后分为两组:复合材料后加成骨诱导剂组:骨髓间充质干细胞先与纳米晶胶原基骨复合培养3d后再加入成骨诱导剂;成骨细胞复合材料组:骨髓间充质干细胞在诱导成骨细胞后与纳米晶胶原基骨复合培养。④实验评估:记录第3代骨髓间充质干细胞生长曲线。将诱导后细胞分别进行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色。扫描电镜比较两组复合物经体外孵育2周后,细胞在其中生长情况。结果:①细胞生长情况:倒置显微镜下观察原代培养的骨髓细胞增殖迅速,基本都呈形态均一成纤维样细胞,10～12d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代。诱导培养后的细胞呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型。②体外复合后细胞生长及基质分泌情况:细胞可在纳米晶胶原基骨内表面良好贴壁,复合材料后加成骨诱导剂组,细胞贴附,但成骨细胞少见;成骨细胞复合材料组,细胞数量明显较前者多。复合培养8d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长。细胞之间广泛存在突起连接,局部有胶原分泌,且可见成骨细胞形成。结论:证实纳米晶胶原基骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖,经成骨诱导后的细胞较骨髓间充质干细胞更易与材料贴附、增殖。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法, 探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对 MSCs增殖的影响.方法 通过密度梯度离心,贴壁法分离培养人胚 MSCs,取第 4代 MSCs,应用流式细胞术测定细胞周期和 CD44、 CD34、 CD45表达.采用 MTT法观察不同含量和不同作用时间的 IGF-I对 MSCs增殖的影响.结果 体外培养的 MSCs呈现成纤维细胞形态,流式细胞仪检测结果显示, MSCs阳性表达 CD44,阴性表达 CD34, CD45.细胞周期分析显示 IGF-I使 S+ G2+ M 期细胞数增加,占细胞总数(29.9± 2.3)%(t=10.4, P< 0.01).1 μ g / L IGF-I促 MSCs增殖作用不明显, 10 μ g / L IGF-I即可促 MSCs增殖, IGF-I含量为 100 μ g / L时,其促增殖作用达最大值,吸光度为 2.95.而当 IGF-I含量大于 100 μ g / L时,促细胞增殖作用反而下降;时效关系显示, IGF-I第 1天发挥促增殖作用,第 5天促增殖作用达高峰,维持时间可达 7 d.结论 外源性 IGF-I能促进 MSCs增殖,为实现 MSCs体外快速扩增提供适宜的条件.     

猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨

目的:如何修复气管缺损是一项医学难题,组织工程技术有望解决这一难题.要构建工程化气管软骨,种子细胞是关键因素之一.探讨利用组织工程方法,将猪骨髓间充质干细胞在体外诱导、培养后,构建软骨组织的可能性.方法:实验于2006-10/2007-05在北京协和医院中心实验室完成.①实验材料:小型猪6只由中国农业大学提供,雌雄不限,体质量15～20 kg;聚羟基乙酸纤维(Equl.com.美国).②实验过程及评估:抽取猪的胸骨骨髓, 经密度梯度离心法在体外进行分离、纯化,得到骨髓间充质干细胞, 并在含有转化生长因子β1的特定培养基内进行培养、诱导,免疫组织化学检测诱导细胞Ⅱ型胶原分泌.将诱导分化的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸支架上,将其作为实验组;对照组为未接种细胞的单纯聚羟基乙酸支架;将两组标本环行包裹于直径为0.4 cm的离心管外表面,植入自体猪皮下,进行体内培养,分别于6,8,10周后取材,进行大体观察和组织学检测,评估工程化软骨的形成.结果:①通过密度梯度离心法可获取骨髓间充质干细胞,对其进行培养扩增后可获得较多的细胞.②猪骨髓间充质干细胞通过特定的诱导后可向软骨细胞分化,诱导细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果为阳性.③猪骨髓间充质干细胞-聚羟基乙酸复合物经过体内第6,8,10周培养后,标本出现软骨组织外观,进行组织学切片可见软骨陷窝,Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学检测为阳性.结论:猪骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化软骨.