与胶原浮胶细胞共培养中内皮细胞血管新生相关基因的表达

背景：内皮细胞和平滑肌细胞的相互调节是稳定血管壁结构的关键因素，两者共同培养能够分别影响各自的形态和功能。目的：利用Ⅰ型胶原浮胶建立人脐静脉内皮细胞与人血管平滑肌细胞共培养体系，分析细胞之间的相互作用。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—10／2008—01在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成。材料：新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院，产妇知情同意。方法：取新鲜脐带，利用胶原酶灌注法分离人脐静脉内皮细胞，组织块培养法分离人血管平滑肌细胞。人血管平滑肌细胞直接种植于培养板表面，人脐静脉内皮细胞种植于鼠尾Ⅰ型胶原表面制成胶原浮胶，并与培养板上的人血管平滑肌细胞共培养。以人脐静脉内皮细胞单独在浮胶底面培养，培养板表面无人血管平滑肌细胞为对照。主要观察指标：①免疫荧光方法鉴定人血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞。光镜和电镜观察人脐静脉内皮细胞形态。②反转录-聚合酶链反应进行基因表达分析。结果：原代培养的内皮细胞呈铺路石样形态，CD31染色阳性。原代培养的人血管平滑肌细胞免疫荧光染色Q-SMA呈阳性。胶原支架上内皮细胞伸展，胶原纤维重新排列，24h后出现管腔样结构。在共培养体系中，人脐静脉内皮细胞的金属蛋白酶1和金属蛋白酶9基因表达量显著高于单独培养组人脐静脉内皮细胞的表达量（P〈0．05）。但层粘蛋白γ2和组织因子途径抑制物2的基因相对表达量在两组间未见明显变化。结论：实验建立的共培养体系，可以观察到与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞形成更加丰富的网络状管腔样结构，更易于血管结构的形成。     

平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养分析

目的对平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养进行分析研究。方法将平滑肌细胞与小肠黏膜下层培养方式作为实验组,将传统平滑肌细胞培养方式作为对照组,通过内皮细胞与平滑肌细胞分离与培养、种植与拟生态环境下培养以及组织工程化血管的自体移植等步骤,对比分析两组培养出的细胞数量情况。结果实验组培养细胞的数量为(36.42±11.01)×105,明显高于对照组中培养细胞的数量(28.16±10.14)×105,差异有统计学意义(P0.05)。结论应用平滑肌细胞与小肠黏膜下层体外复合培养技术对平滑肌细胞进行培养后,其细胞数量明显高于常规培养方法,可以在临床上广泛应用。     

组织工程血管种子细胞的培养

目的：为构建组织工程血管提供种子细胞。方法：全麻下取兔的主动脉，分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞，并传代，免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果：成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代，倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态，平滑肌细胞呈典型的“峰—谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子（ ），平滑肌细胞α—肌动蛋白( )。结论：所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

有机阴离子转运蛋白1在人血管平滑肌细胞表达的意义

[目的]检测有机阴离子转运蛋白1(OAT1) mRNA和蛋白质在人血管平滑肌细胞的表达以及尿酸刺激对其表达的影响.[方法]分离培养人脐动脉血管平滑肌细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR方法扩增特异性OAT1 cDNA片断,制备探针,用Northern blot方法检测OAT1 mRNA的表达,提取细胞膜蛋白和总蛋白,用Western blot方法检测OAT1的蛋白表达;用800 μmol/L的尿酸刺激细胞,观察OAT1的表达变化.[结果]从人血管平滑肌细胞检测到OAT1 mRNA和蛋白的表达.尿酸可以明显增强OAT1的表达.[结论]人血管平滑肌细胞有明确的OAT1表达,OAT1可能部分介导了血管平滑肌细胞对尿酸的摄取过程.     

组织工程血管种子细胞的培养

目的:为构建组织工程血管提供种子细胞。方法:全麻下取兔的主动脉,分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞,并传代、免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果:成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,平滑肌细胞呈典型的“峰-谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子(+),平滑肌细胞α-肌动蛋白(+)。结论:所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础.因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题.组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胸作为血管组织工程种子细胞来源.     

甲基奈醌-4对血管平滑肌细胞钙化的影响

目的探讨甲基奈醌-4对血管平滑肌细胞钙化的影响。方法分别采用生长培养基(磷1. 4 mmol/L)和钙化培养基(磷3. 0 mmol/L),培养人脐静脉血管平滑肌细胞,使用甲基酚酞络合铜法检测细胞基质钙、比色法检测碱性磷酸酶活性、液相色谱法检测细胞内甲基奈醌-4水平,茜素红S染色观察细胞基质钙盐沉积。在钙化培养基下,改变甲基奈醌-4水平,观察细胞基质钙、碱性磷酸酶活性的变化。结果钙化培养基能增加人脐静脉血管平滑肌细胞基质钙含量、碱性磷酸酶活性,减少细胞内甲基奈醌-4水平,细胞外基质出现明显的钙盐沉积。减少甲基奈醌-4的水平能增加基质钙含量、碱性磷酸酶活性。添加甲基奈醌-4能减少基质钙含量、碱性磷酸酶活性。结论甲基奈醌-4能抑制磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础。因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题。组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胞作为血管组织工程种子细胞来源。     

人脐静脉血管内皮细胞分离与原代培养体会

目的:探讨分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和原代培养的可靠方法与经验.方法:利用0.1%胶原酶消化、分离、体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0.125%胰酶-0.02%EDTA溶液消化传代,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化及对乙酰化LDL高摄取试验进行内皮细胞鉴定.结果:脐静脉血管内皮细胞的体外原代培养、传代生长均良好,呈典型的铺路石样形态学表现,Ⅷ因子、CD31细胞免疫组化显示阳性反应,及Dil-Ac-LDL摄取荧光检测提示其具有强摄取能力,从而鉴定为血管内皮细胞.结论:本方法获得的HUVEC量多,方法简单、可靠,为血管内皮细胞的研究提供实验模型.     

可搏利-2号联合绞股蓝对高血脂患者血脂、血浆内皮素和一氧化氮的影响

动脉粥样硬化(AS)的发生、发展中,高脂血症所造成的动脉内皮细胞损伤、一氧化氮(NO)代谢异常及平滑肌细胞(SMC)过度增殖等起关键作用[1,2].因此寻找具有有效降血脂、保护血管内皮细胞(EC)作用,且毒副作用小的中草药,使中药在临床中发挥降脂和抗动脉粥样硬化作用.     

231培养液培养成人大隐静脉平滑肌细胞

目的:应用231培养基培养成人大隐静脉平滑肌细胞探讨其有效方法。方法:实验于2004-11/2005-3在首都医科大学附属北京安贞医院北京心肺血管疾病研究所中心实验室完成。①平滑肌细胞分离:40例冠状动脉旁路移植术患者(年龄43～74岁)术中废弃的大隐静脉,经患者同意无菌取2.0～3.0cm。2.5g/L胰蛋白酶溶液吹打消化15min,去除内皮细胞,同时松动平滑肌细胞,便于细胞游离出组织块生长。将血管剪成2.0～3.0mm2的小块贴到培养瓶底,加入完全231培养液3mL,直立放入37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中,24h后将培养瓶放平使培养液浸没组织块继续培养。②平滑肌细胞传代:当细胞延组织块周围密集成片生长时,即可传代。③平滑肌细胞形态观察:应用倒置显微镜观察平滑肌细胞生长状况,记录生长曲线,观察各生长时期变化。④平滑肌细胞鉴定:应用透射电镜和免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞。结果:①大隐静脉平滑肌细胞形态观察结果:大隐静脉平滑肌细胞原代培养沿组织块长出时间为2～14d,经过7d潜伏期细胞进入对数生长期,细胞呈“峰谷”长势。原代细胞培养第(25±2.1)天传第1代,传代24h后进入对数生长期,细胞传10代以上仍保持良好的形态结构。培养成功率100%。培养过程中未见杂细胞或微生物污染。②大隐静脉平滑肌细胞鉴定结果:电镜下观察,胞浆内富含肌丝,纵向平行排列,胞内有密体,具有平滑肌细胞特征;抗α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色后可见胞浆内染成褐色呈细丝网状,所有细胞均呈阳性染色。证实培养细胞为平滑肌细胞。结论:利用消化贴块方法分离人大隐静脉平滑肌细胞,应用231培养基进行培养,不仅培养成功率高,并且可产生高纯度及多数量的平滑肌细胞。技术具有操作简便,污染机会少,为心血管疾病研究和组织工程学研究及应用提供可靠的细胞模型。     

超声诱导培养大鼠血管平滑肌细胞凋亡的研究

目的　研究不同剂量超声对培养大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)凋亡的影响 ,为超声治疗的临床应用提供实验依据。方法　不同剂量、频率为 650 k Hz的超声波辐照体外培养的大鼠血管平滑肌细胞。照射后 2 4h,用原位末端脱氧核苷酸转移标记 (TUNEL )技术检测凋亡细胞 ,用免疫组织化学方法检测 B细胞淋巴瘤 -2伴 Bax蛋白表达。结果　 1.0 W/ cm2及 0 .5W/ cm2超声辐照细胞 5min,2 4h后细胞凋亡率明显及 Bax蛋白表达率分别显著高于对照组 (P<0 .0 5)。结论　声强为 0 .5W/ cm2 及 1.0 W/ cm2 超声辐照大鼠血管平滑肌细胞 5min,能诱导其凋亡的发生及 Bax蛋白表达率的提高     

内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管:最适比例验证

目的:由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件.实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长,以及两种细胞的最适比例.方法:实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①实验材料:新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院,产妇知情同意.②实验方法及评估:从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞,免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况;采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞,经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型;无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶,在其上以3:1～4:1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞,并观察两种细胞联合培养时的形态,分析两种细胞最合适的种植比例;免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况.结果:①原代培养的平滑肌细胞呈典型"波峰谷"形态,荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性.②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后,呈现出"铺路石"样形态,表达CD31、vWF,结合荆豆凝集素,提示具备成熟内皮细胞特性.③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛,与平滑肌细胞以3:1～4:1的比例种植在I型胶原凝胶培养一段时间后,内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持,形成血管样网络结构.④共培养1周后,CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接,形成环形结构.结论:内皮前体细胞和平滑肌细胞以3:1～4:1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成.     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良

背景:如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。目的:改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。材料:新西兰家兔,体质量2kg左右,用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。方法:以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。主要观察指标:免疫细胞化学法对两者进行鉴定;流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。结果:培养的种子细胞符合各自特征,免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。结论:胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞;第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

结缔组织生长因子与骨重建

结缔组织生长因子(CTGF)是即刻早期基因(CCN)家族的成员之一,最早由Bradham等[1]在1991年用亲和色谱法从人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现,研究表明,CTGFmRNA及其蛋白产物可在内皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞、血管平滑肌细胞和成骨细胞等多种细胞中表达,在机体多种生物学过程,如胚胎发育、瘢痕组织、恶性肿瘤、软骨发生和诱导成骨细胞的分化、     

紫杉醇降解材料对平滑肌细胞生长的影响

背景:冠脉支架后较高的早期急性再闭塞及晚期再狭窄已经成为研究的热点,而生物降解材料携带对抑制再狭窄有效的药物-紫杉醇金属涂层支架有望解决这一问题.目的:寻找出一种用于制作生物可降解支架的生物可降解材料.设计、时间及地点:对比观察的细胞学实验,于2003-07/2005-07在吉林大学公共卫生学院毒理实验室(卫生部放射牛物学重点实验室、吉林省毒理学重点实验室)完成.材料:紫杉醇可降解材料(左旋丙素酯与聚乙交酯的比例为9:1)由中国科学院长春应用化学研究所提供.人脐动脉平滑肌细胞为武汉博士德生物有限公司产品.方法:将培养所得第6代平滑肌细胞用0.25%胰蛋白酶在室温下消化3 min,加入10%牛血清BMEM培养液10 mL,制成平滑肌细胞悬液.将表面处理后用60Co消毒的低温保存材料经水浴加热至37℃,取出置于6孔培养板中,将细胞悬液滴加至材料中部,植入细胞浓度约5×106/cm2,使细胞悬液缓慢向材料周围扩散,最后加入10%BMEM牛血清培养液,放入5%CO2孵箱37℃中培养,每天用倒置显微镜观察材料中及周边细胞生长状态.主要观察指标:分别于培养后第3,6,12,19,26,34天后将材料取出,真空干燥、称质量,比较培养前后材料重量的损失,并计算材料平均降解速率.结果:倒置显微镜观察降解材料对人脐动脉平滑肌细胞的生长没有影响,体外培养的平均降解速率为0.45%/d.结论:此紫杉醇降解材料具有良好的细胞相容性,符合制作血管内支架材料的要求.     

三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的影响水

背景:氧化低密度脂蛋白能诱导血管内皮细胞活化和黏附分子表达,在动脉粥样硬化形成早期起重要作用.三七总皂苷在心血管系统方面具有保护血管内皮细胞、显著改善动脉粥样硬化病变程度的药理作用.目的:验证三七总皂苷对氧化型低密度脂蛋白损伤内皮细胞后血管细胞黏附分子1的表达及与人单核细胞黏附的影响.设计、时间及地点:体外实验,分组对照,于2007-03/2008-05在北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成.材料:原代人脐静脉内皮细胞为美国Cascade Biologics公司产品;三七总皂苷(血塞通冻干粉针)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品,成分为三七总皂苷,批号:20040207.方法:以培养原代人脐静脉内皮细胞作为靶细胞.用氧化型低密度脂蛋白造成人脐静脉内皮细胞损伤模型.将培养的人脐静脉内皮细胞分为5组:氧化型低密度脂蛋白组(100 mg/L)、氧化型低密度脂蛋白+三七总皂苷组(终浓度分别为200,100,50 mg/L)、正常对照组.主要观察指标:光镜下观察细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐法检测细胞活性;采用蛋白定量法检测人脐静脉内皮细胞与单核细胞的黏附率;用流式细胞仪测定人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分子1的蛋白表达.结果:氧化型低密度脂蛋白作用人脐静脉内皮细胞后12,24 h时,人脐静脉内皮细胞损伤明显,细胞活性显著降低,人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率显著升高,人脐静脉内皮细胞的血管细胞黏附分了1的蛋白表达水平也均明显升高,均明显高于正常对照组(P<0.05,P<0.01),而三七总皂苷能使氧化型低密度脂蛋白损伤的人脐静脉内皮细胞形态趋于正常,活性增强,并明显降低人单核细胞与人脐静脉内皮细胞的黏附率,以及显著降低血管细胞黏附分子1的蛋白的表达水平,与氧化型低密度脂蛋白组相比均有显著性差异(P<0.05,P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强.结论:三七总皂苷能通过下调血管细胞黏附分子1的表达抑制单核-血管内皮细胞黏附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用,这可能是其治疗动脉硬化闭塞症的机制之一.     

人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的:建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法:采用1.25g/L胰蛋白酶(2.5g/L胰蛋白酶:0.2g/LEDTA=1∶1V/V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果:原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第VIII因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞。结论:用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

内皮细胞调节的细胞培养液对血管平滑肌细胞增殖和胶原Ⅰ合成的作用

目的建立稳定的人胎盘脐带血管内皮细胞和平滑肌细胞模型来研究:内皮细胞调节的培养液对平滑肌细胞的增殖和胶原Ⅰ产物的影响。方法 (1)细胞培养:内皮细胞培养参照Maruyama的方法,从人胎盘脐带静脉获取。平滑肌细胞参照Fischer-Dzoga等所描述的方法,从人脐带动脉获取。(2)内皮细胞和平滑肌细胞的鉴定:在显微镜下观察细胞外形、用单克隆鼠抗人CD31和兔抗人第八因子(vWF)行免疫组化确认;同样,平滑肌细胞通过显微镜观察细胞外形、用单克隆鼠抗人平滑肌肌动蛋白进行免疫组化来确认。(3)用无血浆的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) 培养液制备内皮细胞调节的细胞培养液。(4)对在内皮细胞调节的细胞培养液刺激下的平滑肌细胞研究:用细胞与3H- 胸腺嘧啶结合闪烁记数法测定平滑肌细胞的增殖;用固相载体酶联免疫法来测定平滑肌细胞释放到培养液中的可溶性胶原Ⅰ的浓度。结果 (1)内皮细胞的鹅卵石状外形、单克隆鼠抗人CD31免疫组化和兔抗人vWF免疫组化均呈阳性反应。平滑肌细胞典型的纺锤样形状,单克隆鼠抗人平滑肌肌动蛋白免疫组化呈现阳性反应。(2)内皮细胞调节的细胞培养液对平滑肌细胞增殖和胶原Ⅰ产物的影响:50％内皮细胞调节的培养液对平滑肌细胞增殖和胶原Ⅰ产物有显著的刺激作用,与对照组相比,实验组平滑肌细胞增殖显著增加到(170．6±13．7)％(P<0．01),胶原Ⅰ产物显著增加到(128．0±7．7)％(P<0．01)。结论内皮细胞调节的细胞培养液在体外有刺激血管平滑肌细胞增殖和提高平滑肌细胞胶原Ⅰ产物浓度的作用。