C反应蛋白抑制血小板内皮型一氧化氮合酶活性

目的 研究不同浓度的纯化重组人C反应蛋白(rhCRP)对正常人血小板内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法 取健康人外周静脉血,用凝胶色谱柱法收集血小板,用同位素二步色谱法测定血小板eNOS的活性.将收集的血小板和组织胺、Nω硝基左旋精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)、不同浓度纯化的rhCRP一起孵育后测定血小板eNOS活性.结果 组织胺可以明显增加血小板eNOS活性;eNOS抑制剂L-NAME可以明显抑制eNOS活性以及用组织胺刺激后的血小板eNOS活性增加;rhCRP明显抑制组织胺刺激后的eNOS活性,且这种抑制作用呈现显著的浓度依赖性.结论 rhCRP对正常人血小板经组织胺诱导的eNOS活性有显著抑制作用,这种抑制作用一定范围内呈现显著的浓度依赖性.     

丹参多酚酸盐对健康人血小板内皮型一氧化氮合酶活性的影响

目的观察不同浓度的丹参多酚酸盐(depside salt from Salvia Miltiorrhiza)对正常人血小板内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响。方法采集健康人外周静脉血,用凝胶色谱柱法纯化血小板,同位素二步色谱法测定血小板eNOS的活性。将收集的血小板分别与eNOS激动剂组织胺和(或)eNOS抑制剂N-ω-硝基左旋精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)或不同浓度丹参多酚酸盐一起孵育30min后测定血小板eNOS活性。结果组织胺可以明显增加eNOS活性;L-NAME可以明显抑制基础状态下血小板eNOS活性以及组织胺刺激后eNOS活性的增加;丹参多酚酸盐在浓度0.1～10mg/L间呈浓度依赖性增加血小板eNOS活性(P<0·05);浓度达10mg/L时这种刺激作用达高峰,更高浓度时血小板eNOS活性反而逐渐降低。结论丹参多酚酸盐在一定剂量范围(<10mg/L)内可以明显增加血小板eNOS活性。     

丹参多酚酸盐对健康人血小板内皮型一氧化氮合酶活性的影响

目的 观察不同浓度的丹参多酚酸盐(depside salt from Salvia Miltiorrhiza)对正常人血小板内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法 采集健康人外周静脉血,用凝胶色谱柱法纯化血小板,同位素二步色谱法测定血小板eNOS的活性.将收集的血小板分别与eNOS激动剂组织胺和(或)eNOS抑制剂N-ω硝基左旋精氨酸甲酯盐酸盐(L-NAME)或不同浓度丹参多酚酸盐一起孵育30 min后测定血小板eNOS活性.结果 组织胺可以明显增加eNOS活性;L-NAME可以明显抑制基础状态下血小板eNOS活性以及组织胺刺激后eNOS活性的增加;丹参多酚酸盐在浓度0.1～10 mg/L间呈浓度依赖性增加血小板eNOS活性(P＜0.05);浓度达10 mg/L时这种刺激作用达高峰,更高浓度时St,b板eNOS活性反而逐渐降低.结论 丹参多酚酸盐在一定剂量范围(＜10 mg/L)内可以明显增加血小板eNOS活性.     

糖基化终产物对正常人血小板内皮型一氧化氮合酶活性及其表达的影响

目的 通过观察糖基化终产物（AGEs)对血小板内皮型一氧化氮合酶（eNOS)活性及其表达的影响，探讨AGEs损伤血小板的机制。方法 健康成人6例，取外周静脉血，用凝胶色谱柱法收集纯化的血小板悬液，分别与三种浓度的AGEs(100μg/ml,200μg/ml，400μg/ml）孵充300min，部分血小板用位素二步色谱法测定血小板一氧化氮合酶（NOS）活性；部分血小板用免疫沉淀法制备经eNOS蛋白，蛋白印迹法检测eNOS蛋白表达水平，结果 AGEs明显抑制正常人血小板NOS纯化eNOS蛋白，蛋白印迹法检测eNOS蛋白表达水平。结果 AGEs明显抑制正常人血小板NOS活性且呈浓度依赖性。正常人血小板表达eNOS；AGEs干预30min不影响eNOS表达水平。结论 AGEs通过抑制血小板eNOS活性而激活血小板，这种作用不是通过降低血小板eNOS表达实现的。     

前列腺素EI对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的探讨前列腺素EI(prostaglandin EI,PGEI)对内皮细胞一氧化氮(NO)表达和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响。方法以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为实验对象,检测不同浓度PGEI作用不同时间后,细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化,以及细胞eNOS活性的改变。结果(1)随着PGEI浓度的升高,eNOS的活性和NO的含量均逐渐增加(P<0.05);(2)短时间PGEI的干预对eNOS和NO的影响均不明显,24h后细胞中eNOS活性明显升高(P<0.05),NO的含量自12h起随时间延长而增加(P<0.05);(3)用不同PGEI浓度预处理,使TNF-α对eNOS活动的抑制作用减弱。结论PGEI可能通过诱导eNOS的表达,促进NO的释放,且可以重新激活被TNF-α抑制的eNOS活性。     

高浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶活性及其蛋白表达的影响

不同浓度葡萄糖及高浓度葡萄糖（高糖）加胰岛素孵育人脐静脉内皮细胞（HUVECs）不同时间后，高浓度葡萄糖呈浓度和时间依赖性明显抑制内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，生理浓度的胰岛素可部分地逆转高糖对eNOS活性及其表达的抑制作用。     

氟伐他汀对人脐静脉内皮细胞游离钙离子水平及内皮型一氧化氮合酶活性的影响

目的:观察氟伐他汀对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)游离钙离子水平及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响及可能机制。方法:体外培养HUVECs,随机分为5组:空白对照组,氟伐他汀(10-8,10-7,10-6,10-5mol/L)组。采用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO含量,液体闪烁计数仪测定L-[3H]-精氨酸和L-[3H]-瓜氨酸的含量,用激光共聚焦扫描显像系统检测内皮细胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]i)水平的变化。结果:与空白对照组比较,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L氟伐他汀孵育细胞12h后可显著升高HUVECs细胞内eNOS活性,促进NO释放,同时伴有[Ca2 ]i升高,且呈浓度依赖性。另外,10-5mol/L氟伐他汀在0～12h时间段呈时间依赖性增高eNOS活性,作用12h使eNOS活性达到最高(P<0.01)。结论:氟伐他汀呈浓度依赖性升高HUVECseNOS活性和促进NO释放,该作用与其增加内皮细胞内[Ca2 ]i有关。     

法舒地尔改善内皮祖细胞功能活性的机制研究

目的:研究法舒地尔对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能活性及一氧化氮(NO)合成的影响。方法:利用密度梯度离心法分离、培养人外周血单个核细胞,由FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色鉴定正在分化的EPCs。将分离、培养的EPCs分为对照组、法舒地尔组(10μmol/L)和内皮型一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME,100μmol/L)干预组。分别采用免疫荧光染色计数法、Transwell小室法、粘附实验以及体外小管形成实验观察法舒地尔干预后EPCs增殖、迁移、粘附以及血管形成能力的变化情况,同时采用Greiss法检测法舒地尔处理后EPCs合成NO的变化情况,应用Western blot计数检测法舒地尔处理EPCs后一氧化氮合酶(eNOS)和磷酸化eNOS(Ser1179)蛋白的表达变化情况。结果:与对照组相比,法舒地尔组EPCs增殖、迁移、粘附以及血管形成等功能活性显著提高,而在L-NAME组,法舒地尔改善EPCs功能活性的作用受到明显的抑制。另外,EPCs经法舒地尔处理后,NO的合成分泌水平以及磷酸化eNOS(Ser1179)表达水平均明显高于对照组(P0.05)。结论:法舒地尔具有促进EPCs增殖、迁移、粘附等功能的作用,其主要机制可能与法舒地尔促进eNOS的活性,进而增加NO的合成分泌有关。     

κ-阿片受体激活后通过caveolin-eNOS途径抑制由软脂酸钠诱导的内皮损伤

目的 探讨κ-阿片受体在对抗软脂酸钠（sodium palmitate,SP）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤中的作用及其作用机制。 方法 体外培养HUVECs并分为6组即正常对照组、κ-阿片受体激动剂U50,488H组、SP组、SP+U50,488H组、SP+U50,488H+κ-阿片受体阻断剂nor-BNI组、SP+U50,488H+eNOS抑制剂L-NAME组。检测各组细胞生存率、测定各组caveolin-1、eNOS的蛋白表达水平,以及NO的产生及细胞凋亡情况。 结果 与正常对照组相比,SP组细胞的生存率明显降低（P<0.01）,caveolin-1的蛋白表达显著增加（P<0.01）,eNOS的活性明显受到抑制（P<0.05）,NO生成量大幅下降（P<0.01）,细胞凋亡显著增加（P<0.01）;而κ-阿片受体激动剂U50,488H可以显著抑制SP的上述作用,使细胞生存率升高（P<0.01）,caveolin-1的蛋白表达均显著降低（P<0.05或P<0.01）,eNOS的蛋白表达显著增加（P<0.05）,NO生成量显著增多（P<0.01）,细胞凋亡明显减少（P<0.01）。U50,488H的作用可被κ-阿片受体阻断剂nor-BNI或NO合酶抑制剂L-NAME所阻断（P<0.05或P<0.01）。 结论 激活κ-阿片受体能够抑制软脂酸钠诱导的内皮损伤,其机制可能与下调caveolin-1表达,增强eNOS活性有关。     

二甲双胍抑制血管紧张素Ⅱ诱导的成年大鼠心脏成纤维细胞增殖

目的　观察二甲双胍对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的成年大鼠心脏成纤维细胞（CF）增殖的影响，并探讨其可能机制。方法　通过胰酶、胶原酶Ⅱ联合消化法获取成年大鼠CF，AngⅡ（100　nmol/L）刺激CF建立细胞增殖模型，并给予不同浓度（10、50及200　μmol/L）二甲双胍进行干预。采用噻唑蓝法观察CF的增殖情况，EdU掺入法测定CF的DNA合成能力。免疫印迹法检测内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表达情况，硝酸还原酶法测定CF培养上清一氧化氮（NO）含量。结果　AngⅡ刺激48　h能够明显促进成年大鼠CF增殖（P<0.05），二甲双胍呈浓度依赖性抑制AngⅡ诱导的CF增殖，二甲双胍呈浓度依赖性增加CF内eNOS磷酸化水平和NO含量（P<0.05），eNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）能阻断二甲双胍抑制AngⅡ诱导的CF增殖的作用（P<0.05）。结论　二甲双胍能抑制AngⅡ诱导的成年大鼠CF增殖，与二甲双胍激活CF内eNOS/NO通路有关。     

家兔动脉粥样硬化与血小板源内皮型氧化氮合酶表达的相关性

目的 探讨家兔动脉粥样硬化及斑块形成与血小板源内皮型氧化氮合酶(eNOS)表达的关系. 方法 设立模型组、治疗组和非治疗组及对照组,每组家兔6只.模型组、治疗组和非治疗组每天给予胆固醇饮食,至12周建立家兔动脉粥样硬化模型,建模后继续喂养至24周,同时治疗组服用普伐他汀10 mg/d;非治疗组仅给予普通饮食.实验终点剥离家兔主动脉观察大体和组织病理形态,反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)方法 检测血小板源eNOS/mRNA水平. 结果 模型组和非治疗组均可见明显动脉粥样硬化和(或)斑块形成;主动脉最大脂纹或斑块厚度占整个血管壁厚度的百分比,对照组、模型组、治疗组和非治疗组分别是0.04±0.02、0.82±0.16、0.33±0.18和0.77±0.14,治疗组与非治疗组比较,差异有统计学意义(F=33.759,P=0.001).血小板(2～4×108/ml)eNOS mRNA表达在对照组、模型组、治疗组和非治疗组分别是1.02±0.28、0.41±0.27、1.00±0.77、0.40±0.29,治疗组较非治疗组明显增高(F=3.544,P=0.02). 结论 血小板源eNOS表达与动脉粥样硬化及斑块的形成呈负相关;普伐他汀对动脉粥样硬化及斑块的逆转作用可能与血小板源eNOS有关.     

急性冠状动脉综合征患者血小板一氧化氮合酶活性及表达改变

观察急性冠状动脉综合征患者血小板一氧化氮合酶活性及表达改变情况。急性冠状动脉综合征患者32例 ,以健康成人 2 2例作对照 ,取外周静脉血后 ,利用凝胶色谱柱法收集血小板 ,用同位素两步色谱法测定一氧化氮合酶活性 ;蛋白免疫印迹增强化学发光法检测内皮型一氧化氮合酶表达水平。结果发现 ,基础状态下血小板一氧化氮合酶活性正常人为 95 6 .0± 4 8.2pmol 10 8血小板 ,急性冠状动脉综合征患者为 5 2 5 .5± 6 0 .8pmol 10 8血小板 ,明显低于正常人 (P <0 .0 1) ,组胺刺激后血小板一氧化氮合酶活性仍低于正常对照组 (P <0 .0 1) ;与正常人相比 ,急性冠状动脉综合征患者血小板内皮型一氧化氮合酶表达无明显改变。结果提示 ,急性冠状动脉综合征患者血小板一氧化氮合酶活性降低 ,一氧化氮释放减少可能是其血小板活化的机制之一。由于血小板粘附 ,聚集白色血栓形成是急性冠状动脉综合征早期事件 ,这对我们认识冠心病发病机理、开发临床新药提供新的思路。     

不同HO-1表达水平对糖尿病模型大鼠血管舒张功能及NOS的影响

目的 探讨改变血红素加氧酶-1(HO-1)表达水平对糖尿病(DM)大鼠血管舒张功能的影响及与一氧化氮合酶(NOS)/一氧化氮(NO)的关系.方法 以链脲佐菌素(STZ)诱导DM大鼠模型.SD大鼠分成4组:对照组、DM组、正铁血红素(HO-1诱导剂)组、锌原卟啉(HO-1抑制剂)组.应用离体血管张力检测技术观察胸主动脉舒张功能变化;RT-PCR法及比色法分别检测血管组织和血清中诱生型NOS(iNOS)及内皮型NOS(eNOS)的表达和NO含量.结果 与DM组相比,正铁血红素组血管环对乙酰胆碱舒张百分率有所提高,而锌原卟啉组血管舒张反应继续下降.应用正铁血红素可在提高DM大鼠血管和血清eNOS表达的同时降低iNOS/NO表达;而锌原卟啉组血清中iNOS活性及其在血管组织表达均增高.结论 提高HO-1的表达水平有益于改善DM大鼠血管舒张反应失调,这种保护作用与抑制iNOS/NO的生成、上调eNOS表达水平有关.     

Regulation of endothelial and myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation

The controlled regulation of nitric oxide (NO) synthesis in endothelial cells and cardiomyocytes by the endothelial form of nitric oxide synthase (eNOS or NOS3) is essential for cardiovascular health. In recent years, a picture of complex and precise regulation of eNOS activity involving multi-site phosphorylation of specific serine and threonine residues has emerged. Regulation of endothelial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation occurs in response to a wide variety of humoral, mechanical and pharmacological stimuli. This regulation involves numerous kinases and phosphatases, as well as interactions with other aspects of eNOS regulation such as Ca(2+) flux, protein-protein interactions and regulation of subcellular localization. Phosphorylation of eNOS-Ser(1177) close to the carboxy-terminal is a critical requirement for eNOS activation. In addition, phosphorylation of eNOS-Ser(633) in the flavin mononucleotide (FMN) binding domain also increases eNOS activity and appears particularly important for the maintenance of NO synthesis after initial activation by Ca(2+) flux and Ser(1177) phosphorylation. In contrast, NO synthesis is inhibited by phosphorylation of eNOS-Thr(495), which interferes with the binding of calmodulin to the eNOS calmodulin-binding domain. Regulated phosphorylation of eNOS also occurs at eNOS-Ser(114) and eNOS-Ser(615); however, the functions of these phosphorylation sites remain controversial. This review summarizes the present knowledge of the regulation of NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation and its relationship to other mechanisms of eNOS regulation. This progress in understanding important mechanisms controlling endothelial NO synthesis creates new opportunities to understand and potentially treat cardiovascular diseases characterized by deficient NO synthesis.     

替罗非班对大鼠心肌缺血再灌注后无复流及一氧化氮合酶活性和一氧化氮含量的影响

目的研究替罗非班对大鼠心肌缺血再灌注后无复流及一氧化氮合酶(NOS)活性、一氧化氮(NO)含量的影响,探讨替罗非班改善心肌缺血再灌注后无复流的作用机制。方法雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组、对照组和替罗非班组。建立急性心肌缺血再灌注无复流模型,用硫黄素S活体染色,观察大鼠心肌无复流范围;伊文斯蓝、氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估大鼠心肌缺血及梗死范围;紫外分光光度计测定缺血再灌注120min时缺血区心肌内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、总一氧化氮合酶(tNOS)活性及NO含量。结果缺血再灌注后120min,替罗非班组大鼠与对照组大鼠心肌缺血范围相似[(43.13±5.69)%比(39.98±3.75)%,P>0.05],但无复流范围及梗死范围明显小于对照组[(34.36±6.04)%比(52.09±6.89)%,P<0.01;(80.41±8.48)%比(90.13±5.72)%,P<0.05);对照组大鼠心肌的eNOS活性低于假手术组,iNOS、tNOS活性及NO含量高于假手术组(P<0.01);替罗非班组大鼠心肌的iNOS活性及NO含量高于假手术组(P<0.05,P<0.01),eNOS、tNOS活性与假手术组差异无统计学意义。与对照组比较,替罗非班组大鼠心肌的eNOS活性高于对照组(P<0.05),iNOS活性及NO含量低于对照组(P<0.05,P<0.01),tNOS活性较对照组有降低的趋势,但差异无统计学意义。结论大鼠心肌缺血90min再灌注120min可发生无复流现象;替罗非班可缩小无复流及梗死范围,其机制可能与保护内皮功能有关。     

Endothelial nitric oxide synthase dysfunction in diabetic mice: importance of tetrahydrobiopterin in eNOS dimerisation

Aims/hypothesis Impaired nitric oxide (NO) bioactivity and increased superoxide (SO) production are characteristics of vascular endothelial dysfunction in diabetes. The underlying mechanisms remain unknown. In this regard, we investigated the role of tetrahydrobiopterin (BH4) bioavailability in regulating endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity, dimerisation and SO production in streptozotocin-induced diabetic mice.Methods Mouse aortas were used for assays of the following: (1) aortic function by isometric tension; (2) NO by electronic paramagnetic resonance; (3) SO by lucigenin-enhanced chemiluminescence and dihydroethidine fluorescence; (4) total biopterin and BH4 by high-performance liquid chromatography; and (5) eNOS protein expression and dimerisation by immunoblotting.Results In diabetic mouse aortas, relaxations to acetylcholine and NO levels were significantly decreased, but SO production was increased, in association with reductions in total biopterins and BH4. Although total eNOS levels were increased in diabetes, the protein mainly existed in monomeric form. Conversely, specifically augmented BH4 in diabetic endothelium preserved eNOS dimerisation, but the expression remained unchanged.Conclusions/interpretation Our results demonstrate that BH4 plays an important role in regulating eNOS activity and its functional protein structure, suggesting that increasing endothelial BH4 and/or protecting it from oxidation may be a rational therapeutic strategy to restore eNOS function in diabetes.