成年犬骨骼肌成肌细胞的培养纯化、鉴定及生长特性的研究

目的 建立简便、有效的成年犬骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblast cells,SMCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,并观察犬SMCs的生长特性.方法 采用机械分解法与IA型胶原酶和胰蛋白酶的二步酶消化法相结合,分离消化法培养获取犬SMCs,用DMEM培养液培养,以Ficoll梯度液纯化,进行Desmin免疫组化鉴定,并观察细胞形态、生长特性.结果 犬SMCs培养后经台盼蓝检查成活率达95%以上,在接种后4～5 d增殖达高峰,细胞生长旺盛;Ficoll分离纯化的SMCs纯度较高;Desmin免疫细胞化学染色有97%的SMCs胞浆呈阳性反应.结论 改良方法获得的SMCs具有良好的增殖、分化能力;采用Ficoll纯化以血清培养,即可获得高产量高纯度的SMCs.     

SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞的原代培养

目的 建立SD大鼠乳鼠咀嚼肌成肌细胞体外培养方法。方法 分离SD大鼠乳鼠咀嚼肌，采用胰蛋白酶和胶原酶多次消化法分离细胞，再用差速贴壁法对细胞进行纯化，所得的细胞进行Desmin免疫组化鉴定。结果 95％的培养的细胞Desmin胞浆呈阳性反应，台盼蓝检查细胞成活率超过94％。结论 多次消化和差速贴壁法可获得高产量高纯度的成肌细胞。     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

小鼠成肌细胞的培养纯化和鉴定方法

【目的】建立体外成肌细胞分离培养、纯化和鉴定方法。【方法】 40只小鼠分 10次采用分离消化法培养成肌细胞 ,分别用A、B、C、D 4组不同培养液培养 ,以Ficoll梯度液纯化 ,进行Desmin免疫组化鉴定。【结果】成肌细胞培养后经台盼蓝检查成活率达 95 %以上 ,在接种后 4～ 5d增殖达高峰 ,A、B、C 3组培养液对成肌细胞的培养效果无差异。Ficoll分离纯化的成肌细胞纯度较高 ,有 97%的成肌细胞Desmin胞浆呈阳性反应。【结果】采用Ficoll纯化以国产血清培养 ,可获得高产量高纯度的成肌细胞。     

新生C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的实验研究

目的建立C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离新生C57BL/6小鼠的成肌细胞,用Percoll分离液纯化细胞,在含15%胎牛血清的DMEM培养基中进行成肌细胞培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,Desmin抗体鉴定成肌细胞。结果经过Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离,Percoll纯化的成肌细胞纯度较高,Desmin染色95%以上的细胞胞浆染色阳性。结论采用Percoll纯化、国产胎牛血清培养,可以获得高纯度的成肌细胞。     

兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

目的建立高纯度、高丰度的兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法,并对培养的肌卫星细胞体外增殖和成肌特性进行观察。方法采用改良I型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法结合差速贴壁培养以分离、纯化1周龄幼兔小腿三头肌来源的骨骼肌卫星细胞。镜下观察肌卫星细胞生长形态,结蛋白(Desmin)免疫组化染色鉴定体外培养的肌卫星细胞,MTT法绘制细胞生长曲线,并对分离培养的肌卫星细胞成肌特性进行诱导培养观察。结果差速贴壁后的悬浮肌卫星细胞折光性强,呈透亮球形,数量较多,贴壁生长后逐渐变为长梭形;免疫组化染色检测分离培养的细胞高表达Desmin,证明为肌卫星细胞,纯度高达95%;传代培养的肌卫星细胞24 h后开始增殖,第3~7天处于对数生长期,第8天后进入平台期;不经诱导分化培养基培养的肌卫星细胞也可融合形成肌管,但形成肌管速度不及诱导分化培养组快速。结论成功建立了具有操作简便、不易污染和纯度高的兔骨骼肌卫星细胞分离、培养方法,为采用肌卫星细胞为种子细胞的再生医学研究奠定实验基础。     

犬骨骼肌卫星细胞的分离,培养及扩增方法探索

为骨骼肌卫星细胞自体移植治疗心肌疾病准备细胞材料,建立了体外分离、纯化、培养、扩增骨岂卫星细胞的方法。用机械法酶的消化法分离犬骨骼肌卫星细胞,在ｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度离心纯化过程后,以Ｄｅｓｍｉｎ链霉一物素一过氧化酶银川市细胞化学染色鉴定。以完全培养扩增卫星细胞。提取的卫星细胞工在９０％以中,且证明促肝细胞生长素能增强细胞的增殖能力。表明此法可获得沆纯度及治疗所需细胞数量。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存

目的建立兔外周血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及冻存的方法。方法用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化兔外周血MSCs，MSCs经液氮冻存半年复苏，观察细胞冻存前后的生长状况，并用台盼蓝法测定其存活率。结果MSCs于体外培养2h开始贴壁生长，细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞，增殖活跃；MSCs经6mo冻存后复苏培养，台盼蓝法计数存活率达95％以上，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形，细胞生长增殖旺盛。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G-CSF动员后的外周血MSCs，且细胞纯度高，生长增殖活性好，采用液氮冻存MSCs的方法十分有效可行。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。     

免膀胱平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的 建立分离、培养高纯度兔膀胱平滑肌细胞的方法,并进行细胞学鉴定与分析。方法 正常成年新西兰白兔共6只,运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后,完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞,体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析,并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。最后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。结果 24 h可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长,7 d可进行传代,传至第10代时细胞仍迅速生长,倒置显微镜下观察细胞相互交叉、重叠生长形成多层,高低起伏呈“谷和峰”样结构,至第12代时,细胞开始变形,至第15代时细胞已失去平滑肌细胞的典型形态特点,细胞生长杂乱且不规则,至第20代时细胞已死亡。以第4代细胞进行形态学细胞爬片H-E染色和透射电镜观察分析,以及平滑肌特有的α-肌动蛋白免疫荧光染色分析均证实,该分离培养的细胞为膀胱平滑肌细胞,且纯度高达100%。结论 酶分离法在短时间内成功培养大量高纯度的膀胱平滑肌细胞,为深入研究膀胱平滑肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定

目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法。方法以成年同种系Wistar大鼠为研究对象,采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养,对获得的细胞进行形态学研究,以免疫组织化学方法进行鉴定。结果细胞增殖旺盛,分化良好,可融合成肌管。免疫细胞化学染色显示,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性,肌管呈强阳性。结论两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞,操作简单、污染少。     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

犬骨髓间充质干细胞体外诱导分化的平滑肌细胞的组织培养及鉴定

目的：应用条件培养基体外诱导成年犬骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞,探讨其作为构建组织工程血管种子细胞的可行性。方法：应用DMEM添加PDGF-BB和维生素C(VIT-C)体外培养通过密度梯度离心法得到的骨髓单核细胞,通过形态学观察鉴定培养的细胞,采用免疫荧光法检测4～6代细胞中平滑肌细胞特异性标记α-肌动蛋白（α-SMA）和肌球蛋白重链SMMHC,应用流式细胞术检测第5、6代细胞中平滑肌细胞的阳性率。结果：犬骨髓间充质干细胞在条件培养基的诱导下稳定传代至第6代后达到种子细胞的种植数量10⁷～10⁸,单独DMEM培养需要42　d,添加PDGF-BB/VIT-C后时间减少为33　d。细胞免疫荧光结果提示,大部分细胞α-SMA阳性、SMMHC阴性;流式细胞术结果显示,第5、6代细胞的α-SMA阳性率分别为57.8%和66.8%。结论：体外条件培养基能诱导犬骨髓间充质干细胞增殖分化为平滑肌细胞,并可作为组织工程血管构建的种子细胞。     

实验性大鼠肝脏星状细胞的培养

目的完善大鼠肝星形细胞(HSC)的体外分离及培养方法,为肝纤维化的基础实验研究提供技术支持。方法选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC,通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。结果分离得到HSC,细胞得率为2×107/只,存活率为96%。结论通过本法成功分离及培养HSC,且方法经济、简便、稳定,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

大鼠腓肠肌肌源细胞的培养与鉴定

目的寻求大鼠肌源细胞体外大量培养及鉴定的方法,为临床直接使用自体肌源细胞注射治疗肌组织损伤疾病奠定实验基础。方法利用胶原酶和胰蛋白酶消化3周龄大鼠腓肠肌,应用选择性培养基抑制非肌源细胞生长,采取改良的差速贴壁法纯化肌源细胞,通过形态观察、免疫组化及RT-PCR进行鉴定。结果使用F-10培养基获得了大量高纯度的大鼠肌源细胞;倒置显微镜下可观察到聚集成团和散在分布的两种形态的肌源细胞;免疫组化显示肌源细胞Desm in阳性率约90%,聚集成团的为CD34＋,大部分单个存在的为CD34-;RT-PCR显示传代细胞中均有Desm in基因的表达。结论此培养方法可在体外获得大量大鼠肌源细胞,有助于基因工程及组织工程等领域的研究。     

成年兔坐骨神经雪旺细胞的分离纯化培养

目的：探讨从成年新西兰兔坐骨神经分离培养获得大量雪旺细胞的有效手段,方法：利用成年免发生Wallerian变性的坐骨神经用植块法进行培养,通过相差显微活细胞计数和S－100细胞化学标记相结合鉴定了雪旺细胞增值和纯化程度。结果：通过上述方法获得大量雪旺细胞纯度达95％,并绘制其生长曲线,体外培养的雪旺细胞倍增时间为8d。结论：本方法能获得大量高纯度的雪旺细胞,为组织工程修复周围神经缺损打下基础。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.