杆状病毒介导的GFP转染与退变的兔椎间盘髓核细胞

目的:检测杆状病毒转染正常与退变的椎间盘髓核细胞的效率以及杆状病毒介导的GFP基因(Ac/CMV/GFP)在正常与退变细胞中的表达水平。方法:取新西兰大白兔的髓核细胞进行离体培养,第1组:健康幼兔;第2组:椎间盘退变模型兔;第3组:椎间盘发生自然退变的成年兔。以200MOI杆状病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)转染离体培养的细胞,于第48h采用流式细胞仪检测转染效率,同时采用HPIAS2000图像分析软件半定量分析外源性GFP基因的表达水平。结果:3组细胞被转染的百分率分别为84.4±3.4,82.9±5.7,81.8±5.5(P>0.05)。外源性基因表达荧光蛋白的光密度值分别为0.0054±0.0029,0.0052±0.0032,0.0056±0.0031(P>0.05)。结论:杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关,杆状病毒介导的外源性基因能在正常与退变的髓核细胞中高水平的表达。     

转基因髓核细胞移植对兔腰椎间盘退变的影响

目的：椎间盘退变是引起腰背痛的主要原因。将腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）介导的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1) 双基因体外联合转染兔椎间盘髓核细胞后,再移植于退变椎间盘内,观察椎间高度、II型胶原和蛋白多糖合成的变化,以探讨体外延缓或逆转椎间盘细胞退变的方法。方法 20只新西兰大白兔应用CT引导下的微创穿刺法建立兔椎间盘退变模型。以rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1体外转染培养的兔髓核细胞,再将其显微注射于退变椎间盘内作为细胞移植组;退变椎间盘内注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为退变对照组;正常椎间盘作为空白对照组。分别于6、10、14周行X线和MRI检查观察椎间高度的变化及椎间盘信号的改变,Western-blot鉴定细胞因子CTGF和TIMP1在椎间盘内的表达,35S整合法测定兔髓核组织蛋白多糖合成率,RT-PCR检测II型胶原及蛋白多糖mRNA的表达。结果 MRI证实CT引导下经皮微创穿刺2周后椎间盘开始退变。与退变对照组相比,MRI显示细胞移植组椎间盘退变明显减轻,转基因兔髓核细胞移植可减缓椎间高度(DHI)下降的发生率,转基因细胞移植组较退变对照组相比,Ⅱ型胶原含量和蛋白多糖的生物合成明显增加,差别有统计学意义（P﹤0.05）。结论 经皮CT 引导下穿刺可成功建立兔椎间盘退变模型。转双基因CTGF和TIMP1 髓核细胞移植可有助于椎间高度的维持,促进椎间盘内蛋白多糖和II型胶原的生物合成,明显延缓椎间盘退变。     

枸杞多糖对大鼠腰椎间盘退变影响的形态学观察

目的探讨枸杞多糖(LBP)对大鼠退变腰椎间盘的形态学的影响。方法将健康雄性SD大鼠42只,随机分为假手术组、椎间盘退变组、LBP干预组,每组14只。采用手术方法制作大鼠腰椎间盘退变模型,LBP干预组在造模后4周,每天上午8:00灌胃给药,80mg.mL-1,容量为1mL.kg-1,连续4周。假手术组及椎间盘退变组分别给予等容量生理盐水灌胃,连续4周。在造模后8周三组所有大鼠再次麻醉,取出椎间盘组织,分别在光镜及电镜下观察椎间盘形态学的变化。结果 HE染色光镜观察假手术组髓核细胞丰富,形态不规则,集中成簇;椎间盘退变组髓核细胞稀少,细胞基质见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞有变性、坏死,但较椎间盘退变组退变程度减轻。电镜下假手术组的髓核细胞多见,核膜完整,细胞器丰富;椎间盘退变组髓核细胞减少,细胞器缺失,见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞减少,有变性、坏死,退变较椎间盘退变组减轻。结论 LBP可能对大鼠腰椎间盘髓核组织退变有延缓作用。     

兔椎间盘髓核细胞体外培养自然退变的观察

目的 观察体外培养的兔髓核细胞不同代数之间细胞形态、NOS活性、NO含量、细胞总蛋白含量的变化;制作兔髓核细胞体外培养的退变模型.方法 酶消化及自然传代法分离培养体外兔椎间盘髓核细胞,HE染色光镜观察髓核细胞形态;利用分光光度法检测P1、P3代细胞培养液中NOS活性和NO含量,考马斯亮蓝法检测细胞总蛋白含量.结果 ①成功建立了兔椎间盘髓核细胞的体外培养模型;②随着传代次数的增加,细胞内一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和NO分泌增加,但细胞总蛋白含量却降低,差别具有统计学意义.结论 通过体外培养兔髓核细胞并进行自然传代,随着传代次数的增加,髓核细胞呈现自然退变现象,为髓核细胞退变机理的研究提供了细胞学基础.     

白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织形态学的影响

目的观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织影响的病理改变及超微结构变化。方法将大鼠36只随机分为正常对照组、椎间盘退变组和白藜芦醇药物干预组各12只,应用HE染色光镜观察各组腰椎间盘髓核组织的病理改变,在电镜下对其进行超微结构的观察。结果光镜下可见正常对照组较多的脊索细胞和类软骨细胞增殖活跃,椎间盘退变组髓核的细胞减少,白藜芦醇药物干预组髓核细胞减少较椎间盘退变组程度轻;电镜下正常对照组的椎间盘髓核组织超微结构的病理改变不显著,而椎间盘退变组表现为髓核细胞减少,出现不同程度的退变、坏死,白藜芦醇药物干预组中退变程度明显减轻。结论通过光镜、电镜下观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织有延缓或抑制作用,可为白藜芦醇预防和治疗椎间盘退变提供相关的实验依据。     

经皮微创纤维环穿刺法制作兔椎间盘退变模型

目的应用经皮微创穿刺方法制造兔腰椎间盘退变模型。方法在C型臂X光机监控下,定位18只兔子的L3/4、L4/5、L5/6椎间盘,应用经皮穿刺方法穿刺纤维环,每组行MRI检查后予以处死,取L3/4、L4/5、L5/6椎间盘髓核组织行HE染色观察髓核细胞,用免疫组化染色法观察Ⅱ型胶原蛋白染色情况,取L2/3及L6/7正常间盘组织作为对照。结果造模前后椎间盘髓核的MRI信号强度有随造模手术后的时间延长而逐渐降低的趋势(L3/4、L4/5及L5/6,P<0.05)。病理HE染色观察发现,对照组正常的髓核组织中有大量的髓核细胞,随着通过微创法制作兔腰椎间盘退变动物模型后时间的延长纤维环细胞、髓核细胞数量逐渐减少,到第12周时,髓核组织中只有很少量的髓核细胞,却有很多纤维软骨组织。对照组及术后4、8、12周组Ⅱ型胶原免疫组化染色的灰度值单因素方差分析结果 F=41.82,P<0.05,组间比较LSD-t检验结果显示除术后4周与8周组比较差异无统计学意义外,其余组间比较均有显著差异(P<0.05)。结论成功建立了新的微创兔腰椎间盘退变动物模型。     

FGF18对兔椎间盘退变抗分解代谢作用及调节机制

目的 探讨纤维母细胞生长因子18(FGF-18)在兔椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)发生过程中抗分解代谢作用及对凋亡的抑制作用.方法 取新西兰大白兔45只,体重为2.5~3.0kg.随机分为3组,每组15只,行纤维环穿刺造模(分别在L₃~L₄、L₄~L₅及L₅~L₆椎间盘进行穿刺),造模后予椎间盘内注射阳性过表达FGF18慢病毒(干预组)、阴性慢病毒(模型组),假手术组仅暴露椎间盘不做针刺处理.术后4周、8周将各组大白兔处死取材,分离椎间盘.实时荧光定量PCR和蛋白印记检测细胞外基质降解酶MMP-3、ADAMTS-5表达变化.HE染色及组织学评分评估椎间盘退变情况.免疫组化法检测caspase-3的表达并经统计学分析.TUNEL法检测各时间点髓核细胞凋亡率.结果 术后8周时,各手术组的MMP-3、ADAMTS-5表达均高于假手术组,干预组表达低于模型组.组织学提示FGF18处理延缓椎间盘退变.免疫组化结果显示各手术组caspase-3阳性表达髓核细胞均较假手术组明显增多,干预组较模型组下调.定量分析TUNEL染色显示干预组凋亡髓核细胞较模型组亦减少.结论 髓核细胞过表达纤维母细胞生长因子18可抑制细胞凋亡,进而延缓椎间盘退变进程.     

骨髓间充质干细胞透明质酸钠溶液修复大鼠早期退变椎间盘的作用

目的研究无外源性生长因子及细胞支架的作用下，应用体外培养传代的骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）与透明质酸钠混合溶液修复大鼠早期退变椎间盘的作用。方法取同种基因大鼠的BMSCs，通过贴壁法培养传代，与医用透明质酸钠混合配制。10只SD大鼠，尾椎上取相邻3个椎间盘，由近端至远端设为细胞植入组、椎间盘退变组、正常对照组。分别于细胞植入组、椎间盘退变组建立退变模型。1周后，细胞植入组注射BMSCs与透明质酸钠溶液。3周后，X线片比较椎间盘高度指数（discheightin-dex，DHI），组织病理学方法行病理观测并评分，RT-PCR测定Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达。结果细胞植入组的DHI值与椎间盘退变组相比无明显改善且远低于对照组。病理切片结果提示植入组髓核纤维环的形态得到保留，髓核纤维环边界清晰，细胞产生增殖分裂，其病理学评分明显高于椎间盘退变组。RT-PCR结果提示细胞植入组Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA表达水平较椎间盘退变组明显提高。结论在椎间盘退变早期植入BMSCs与透明质酸溶液可以延缓椎间盘的退变，而不需要外源性细胞因子和三维支架的作用。     

IGF-1,OP-1在椎间盘退变中的作用分析

目的 观察IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、OP-1(成骨蛋白-1)在大鼠尾椎椎间盘退变中的作用.方法 利用Lindblom折尾加压法建立鼠尾椎椎间盘退变模型,将外源性IGF-1,OP-1在不同时间、不同部位分两次向同一退变尾椎椎间盘髓核内注射.4周后取材,光镜下观察椎间盘形态、厚度,软骨陷窝中细胞密度,分析AB-PAS染色标本髓核中蛋白多糖的MOD值.免疫组织化学SP法检测鼠尾椎椎间盘软骨板内细胞PCNA表达情况,计算阳性表达率.结果 ①HE染色:与对照组比较,OP-1组内层纤维环胶原增粗,排列整齐,陷窝中细胞密度高.两实验组髓核完整性较好,无明显缺失.②AB-PAS染色:与对照组相比,IGF-1,OP-1组椎间盘厚度均增加,髓核的MOD值增加,两实验组比较无明显差异.③免疫组织化学染色:OP-1组软骨细胞PCNA阳性表达率高于IGF-1与对照组.结论 ①鼠尾椎椎间盘内注射生长因子可以刺激细胞增殖,增加胶原和蛋白多糖释放,从而促进退变椎间盘的修复;②在PGs合成方面,两生长因子效果无明显差异,OP-1促进细胞增殖、胶原合成、逆转退变过程的效果优于IGF-1.     

MMP-1及TIMP-1在人退变椎间盘髓核中的表达

目的测定MMP-1及TIMP-1在人退变椎间盘髓核中的表达,探讨其在人椎间盘退变发生、发展中的作用。方法选取2009～2010年青海大学附属医院骨科腰椎间盘突出症手术切除髓核标本25例及外伤致胸腰椎骨折切除髓核15例作为对照组。采用免疫组化法检测退变椎间盘髓核细胞中MMP-1及TIMP-1表达。结果在椎间盘髓核细胞中MMP-1的表达病例组的阳性率高于对照组（P〈0.01）;椎间盘髓核细胞中TIMP-1的表达病例组阳性率高于对照组（P〈0.01）。结论退变椎间盘髓核细胞中MMP-1及TIMP-1表达升高,退变椎间盘髓核细胞中MMP-1/TIMP-1失调,在椎间盘突出的发生、发展中发挥重要作用。     

柚皮苷通过Fas膜受体通路调控髓核细胞凋亡的机制研究

[目的]观察中药骨碎补单体柚皮苷（Naringin）对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为治疗椎间盘退变提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用番红O染色和甲苯胺蓝染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用柚皮苷0 g/mL （对照组）、柚皮苷20 g/mL、柚皮苷40 g/mL、柚皮苷80 g/mL的培养基培养人髓核细胞48 h,噻唑蓝（MTT）法选择其抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡的最佳浓度,并用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。实时定量聚合酶链锁反应（qRT-PCR）检测Fas、FasL、Caspase-8基因表达。蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测Fas蛋白表达。[结果]MTT法和流式细胞检测均测定20 g/mL柚皮苷为抑制髓核细胞凋亡的最佳浓度（P<0.05）。qRT-PCR检测20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8 mRNA表达（P<0.05）。Western-blot检测显示20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8蛋白表达。[结论]柚皮苷可能通过调控Fas/Fasl死亡受体凋亡通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡。     

胶原酶在腰间盘突出症中的变化及意义

目的：研究胶原酶在腰间盘突出症中的变化，探讨腰间盘突出症发生的机理。方法：共收集健康成人腰间盘20例，腰间盘突出症突出髓核31例，提取并测定其胶原酶。结果：突出髓核中胶原酶活性低于正常组（P＜0．05），突出髓核中胶原含量升高与胶原酶活性降低呈平行关系。结论：髓核胶原酶活性降低与腰间盘突出症的发生相关。     

正常与退变髓核细胞II型胶原蛋白和番红染色的研究

目的对正常与退变椎间盘髓核细胞（Nucleus pulposus of intervertebraldiSC）II型胶原蛋白免疫荧光染色及番红“O”染色进行比较。方法对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色及细胞内II型胶原蛋白行免疫荧光染色。结果（1）免疫荧光染色：退变椎间盘髓核细胞轻度染色,呈类圆形,染色模糊,细胞内仅有极少量荧光颗粒;（2）番红“O”染色：退变盘髓核细胞形态不规则,细胞核染色较淡,形态不规则,细胞突起及胞浆染色不均匀,部分细胞组织结构分解,完整性消失,细胞稀疏,排列混乱,有的可见少量细胞坏死区。结论正常与退变椎间盘髓核细胞比较,在退变的椎间盘中髓核细胞数量减少、部分凋亡,髓核细胞内的Ⅱ型胶原蛋白含量明显减少。     

白细胞介素-1β诱导人椎间盘髓核细胞凋亡

目的：探讨人正常椎间盘髓核细胞的培养方法以及白细胞介素-1β（IL-1β）对人椎间盘髓核细胞凋亡的作用。方法：取特发性脊柱侧弯患者腰椎间盘髓核组织,用胰酶、胶原酶序贯消化法消化细胞,并用甲苯胺蓝、番红-O染色和Ⅱ型胶原免疫组化分别检测糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达,分别用20μg/L和200μg/L重组人IL-1β刺激髓核细胞24 h,检测其凋亡率。结果：用酶消化法可成功分离培养人椎间盘髓核细胞,检测所培养细胞可表达糖胺多糖、蛋白多糖和Ⅱ型胶原,IL-1β20μg/L组中细胞凋亡率（8.46%）和IL-1β200μg/L组（19.00%）分别为空白对照组（2.86%）的2.95倍和6.63倍（P〈0.05）,IL-1β200μg/L组是IL-1β20μg/L组的2.24倍（P〈0.05）。结论：用酶消化法可成功培养人椎间盘髓核细胞,IL-1β可以诱导椎间盘髓核细胞凋亡,并且随着浓度升高凋亡率增加,提示炎症因子IL-1β在退变椎间盘细胞凋亡中起了重要的作用。     

糖尿病大鼠终板微血管改变与髓核细胞凋亡的关系

目的:观察糖尿病大鼠椎间盘软骨终板微血管的改变和髓核细胞的凋亡情况,探讨糖尿病引起椎间盘退变的可能机制.方法:30只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组15只.实验组采用腹腔单次注射链脲佐菌素溶液(STZ)50 mg/kg制成糖尿病模型,正常对照组仅注射等量的枸橼酸缓冲液.分别在建模成功后4,8,12周取腰椎间盘组织,HE染色观察椎间盘组织病理变化;用免疫组化的方法显示终板微血管,并进行计数;再用TUNEL法显示髓核组织细胞凋亡情况,测定凋亡率. 结果:在不同的阶段,实验组椎间盘的退变程度均较重,终板微血管计数均低于对照组,髓核细胞凋亡率也较高.两组终板微血管计数与髓核细胞凋亡率之间存在着负相关关系(对照组r=-0.953,实验组r＝-0.936,均为P<0.05).结论:与对照组相比,实验组终板微血管计数与髓核盘细胞凋亡率均具有显著性差异,糖尿病所伴发的终板微血管改变可能是导致椎间盘细胞凋亡的因素之一.     

Bcl-2蛋白表达与人类不同年龄段椎间盘组织细胞凋亡的相关性研究

目的:探讨凋亡相关蛋白Bcl-2在人类不同年龄段椎间盘组织细胞凋亡的作用.方法:采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)、免疫组织化学方法以及HE染色法对人类...     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型的建立

【摘要】 目的 建立大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型。方法 为了充分模拟退变椎间盘内营养缺乏的微环境，本实验分别采用含1%，3%，5%，8%，10%胎牛血清的DMEM培养基培养椎间盘髓核细胞，筛选最佳促凋亡浓度，分别检测髓核细胞凋亡率、凋亡相关蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表达、细胞增殖曲线及免疫荧光分析。 结果 流式细胞仪测得髓核细胞凋亡率随着FBS浓度降低而升高，3% FBS为最有效诱导凋亡浓度；Western blot 示Bax、caspase-3酶表达在3% FBS组明显高于10% FBS组，同时bcl-2表达下降；CCK-8检测结果显示含3% FBS的培养基内，随着凋亡率的增长，髓核细胞增殖的速率越来越慢；免疫荧光分析3% FBS组FAS表达量明显比10% FBS组增高。结论 3% FBS能诱导髓核细胞发生凋亡，最终会导致细胞功能丧失，caspase家族参与并执行了这一过程。     

微载体旋转立体培养对成人退变髓核细胞凋亡调控的研究

目的 采用微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞进行扩增,研究细胞凋亡情况,探讨髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用。方法 手术切除的退变髓核组织行原代培养,传代后随机进行单层培养和微载体旋转立体培养,采用Annexin-V-PI染色,流式细胞仪定量检测早期细胞凋亡,应用免疫组化方法检测凋亡抑制因子Bcl 2的表达,DeadEndTM比色法检测细胞晚期凋亡情况。结果 流式细胞仪定量检测可见细胞在稳定生长期时,微载体旋转立体培养法较单层培养法髓核细胞的凋亡率低（P<0.05）,在对数生长期两种培养方法无明显差别（P>0.05）。Bcl-2指标及DeathEndTM比色法检测显示在两个时期内,微载体旋转立体培养法培养的细胞凋亡率较低（P<0.05）。结论 微载体旋转立体培养法可较好地降低髓核细胞凋亡率,是一种较有前途的髓核细胞培养方法,为组织工程化椎间盘髓核种子细胞的研究奠定了基础。     

肿瘤坏死因子-α作用下椎间盘退变动物模型的建立

目的:制作家兔椎间盘退变（IVDD）的动物模型,研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对髓核组织的影响。方法:取健康成年家兔30只,手术暴露L₂~L₆,L_3/4、L_4/5作为实验组,每个椎间盘髓核注射20 ng/μL TNF-α 15 μL;L_5/6作为对照组,每个椎间盘髓核注射15 μL磷酸缓冲盐溶液;L_2/3作为空白组,不做处理。于术后4周、8周、12周行腰椎X线及磁共振（MRI）检查,每次随机检查10只家兔,检查完后处死并取其髓核组织经行免疫组织化学及原位末端标记检查。结果:术后4~12周,X线见实验组椎间隙高度进行性下降,MRI可见实验组椎间隙T2加权像信号逐渐降低;免疫组织化学及TUNEL显示实验组髓核组织内Ⅰ型胶原及细胞凋亡率随之时间推移逐渐增加,Ⅱ型胶原逐渐减少。对照组和空白组差异无统计学意义（P>0.05）。结论:实验成功建立了TNF-α作用下的IVDD动物模型。TNF-α介导的椎间盘术后椎间隙高度丢失,同时TNF-α可诱导椎间盘髓核细胞退变及凋亡。微量注射器的穿刺作用对髓核细胞的退变及凋亡无明显影响。