中药三萜皂苷合成通路的生物信息学分析

目的从系统进化学角度对中药三萜皂苷合成通路中关键酶进行生物信息学分析。方法从NCBI数据库下载已有17种中药中的鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶、2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白质全长序列,通过生物信息学软件对其进行理化性质分析、保守域分析、蛋白质三维结构预测和系统进化树的构建。结果序列分析表明,鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶、2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白质序列保守性均较高。其中鲨烯合成酶具有两个高度保守的区域——富含天冬氨酸的镁离子结合位点1和2——可作为认定鲨烯合成酶的依据;鲨烯环氧酶和2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白三维结构保守,无规则卷曲部分为高变区。结论上游合成在进化中趋于保守和稳定;三萜皂苷众多类型的形成可能与下游细胞色素P450、糖基转移酶、β-糖苷酶等的修饰有关。     

药用植物鲨烯环氧酶基因研究进展

鲨烯环氧酶在角鲨烯合成2,3-氧化鲨烯的过程中起催化作用,继而影响以2,3-氧化鲨烯为前体的三萜皂苷、甾体皂苷等药用植物次生代谢产物的生物合成。鲨烯环氧酶被认为是萜类、甾醇类物质生物合成途径中的关键酶,已在多种药用植物中被广泛研究。概述鲨烯环氧酶基因的克隆提取材料与生物信息学分析、组织特异性与茉莉酸甲酯（MeJA）诱导调控、亚细胞定位、基因功能分析几个方面的研究进展。     

多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响

目的 分析外源多胺对白桦悬浮细胞生长和三萜积累的影响。方法 在白桦悬浮细胞的生长末期添加0.1 mmol/L和1.0 mmol/L的腐胺（Put）、精胺（Spm）和亚精胺（Spd）,采用比色法和RT-PCR方法分析白桦三萜量及其合成关键酶羽扇豆醇合酶（LUS）基因的表达。结果 除1.0 mmol/L Spm处理使白桦悬浮细胞的活力和干质量积累降低外,其他处理均提高了白桦悬浮细胞的活力、干质量积累和三萜产量,且随着处理时间的延长,干质量积累和三萜产量呈增加趋势。其中1.0 mmol/L Put在处理的第2天对细胞干质量和三萜产量的促进效应最大,分别比对照增加了38.89%和116.35%。LUS基因的RT-PCR检测结果进一步证实了多胺对白桦三萜积累的促进作用。结论 Put可有效促进白桦悬浮细胞生长和三萜积累。     

一氧化碳对白桦悬浮细胞生长和三萜累积的影响

目的分析外源一氧化碳(CO)对白桦悬浮细胞生长和三萜累积的影响。方法在白桦悬浮细胞培养的第8天添加5、10、20、30μmol/L的CO供体高铁血红素处理0.25～8 d,采用高效液相色谱法、比色法和实时荧光定量PCR方法分析白桦三萜含量及其合成关键酶基因的表达。结果除20和30μmol/L CO处理2 d后显著降低白桦悬浮细胞干质量外,CO处理未对白桦悬浮细胞干质量产生显著影响。除30μmol/L CO处理提高pH值和丙二醛含量外,CO处理未对pH值和丙二醛含量产生显著影响。CO处理不同程度地增加了三萜、白桦酯醇和齐墩果酸含量,其中,30μmol/L CO处理1 d时三萜积累量达最大值,为同期对照的1.3倍;10μmol/L CO处理4 d时白桦酯醇含量达最高值,为对照的1.5倍;10μmol/L CO处理2 d时齐墩果酸含量达最高值,为对照的4.2倍。三萜合成关键酶FPPS、LUS、CAS1、CAS2和β-AS基因的实时荧光定量PCR检测结果进一步证实了CO对白桦三萜累积的促进作用。结论 CO处理促进了白桦悬浮细胞中三萜的合成。     

建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究

泽泻鲨烯合酶(Ao SS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶。为深入研究Ao SS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体p Czn1上,并在大肠杆菌BL21(Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻Ao SS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中Ao SS表达最高,其次为叶,根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展Ao SS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。     

红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法根据绞股蓝与罗汉果SS基因c DNA比对分析的结果,设计SS的5’端简并引物,采用3’RACE扩增红花栝楼SS全长c DNA基因。结果获得红花栝楼SS c DNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基。通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78%~94%,核苷酸的同源性为74%~93%。结论成功克隆了红花栝楼SS的全长c DNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)进行基因全长克隆和生物信息学分析。方法以桑黄总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆桑黄SE基因的全长c DNA和DNA序列,并通过Ex PASy在线分析等方法对其进行生物信息学分析。结果序列分析表明,SE基因全长2 145 bp,包含6个外显子和5个内含子;所克隆的c DNA全长为1 856 bp,包含1个1 452 bp的开放阅读框,编码483个氨基酸的蛋白,命名为Ib SE1,预测该蛋白的相对分子质量为5.3×104,等电点(p I)为8.41,无信号肽。结论首次克隆并获得桑黄鲨烯环氧酶基因全长序列,为进一步阐明桑黄三萜代谢途径和改善中药材品质奠定基础。     

山楂鲨烯合酶CpSQS1,CpSQS2的基因克隆及原核表达分析

为认识山楂三萜成分生物合成途径中鲨烯合酶基因结构特征,克隆获得山楂鲨烯合酶基因并进行生物信息学分析和原核表达分析。通过RT-PCR方法从山楂果实中克隆获得2条鲨烯合酶CpSQS1,CpSQS2的基因,其ORF长度分别为1239,1233 bp,分别编码412,410 aa。使用在线工具预测CpSQS1,CpSQS2均为稳定的酸性蛋白,二级结构主要由α-螺旋结构组成,利用同源建模对三级结构进行预测;结构功能域分析表明,CpSQS1和CpSQS2的35~367 aa都具有反式异戊烯基焦磷酸合酶的保守结构域;跨膜结构域分析预测CpSQS1,CpSQS2均具有2个跨膜结构域;序列分析表明山楂、丹参、甘草SQS基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性;系统进化树分析显示CpSQS1,CpSQS2与蔷薇科的苹果MdSQS1,MdSQS2聚为一支,与系统进化规律一致;构建原核表达载体pGEX-4T-1-CpSQS1,pGEX-4T-1-CpSQS2转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达,在65 kDa处均能成功表达出目的蛋白;基因表达分析结果显示,CpSQS2的基因表达水平在山楂的3个不同发育时期均明显高于CpSQS1。该研究首次克隆并分析了山楂SQS1,SQS2基因,为进一步研究山楂三萜生物合成途径奠定基础。     

茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

目的：从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶（SE）,并对其进行生物信息学及表达分析。方法：采用试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板,进行SE基因的克隆,对该基因进行生物信息学分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检查茯苓鲨烯环氧酶基因（PcSE）在茯苓神舟10号、湘靖28、5.78菌株中的表达。结果：PcSE的基因全长为1 571 bp,包含4个外显子,3个内含子。获得编码区域（CDS）序列长为1 413 bp,编码470个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,有2个跨膜结构域,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,定位于线粒体或质膜上。与多孔菌科真菌的同源序列比对一致性为80.92%;系统进化树显示PcSE蛋白与美国茯苓的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示,PcSE基因在3个菌株中均有表达,在5.78菌株中的表达量最高,3个菌株的PcSE表达差异不存在统计学意义。结论：首次从茯苓中克隆并分析茯苓PcSE基因,为进一步研究茯苓PcSE的功能及解析茯苓三萜生物合成途径提供了基础...     

野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达

目的:对野三七中可能参与三萜皂苷合成的关键酶鲨烯环氧酶基因(Pvf SE)进行克隆,并对其进行生物信息学分析和原核表达。方法:采用Trizol法提取野三七根的总RNA并反转录为c DNA第一链,基于野三七的转录组数据,设计Pvf SE基因序列特异性引物,克隆基因全长,利用相关软件对该基因进行生物信息学分析,构建p Mal-c2X-Pvf SE原核表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达重组蛋白。结果:Pvf SE开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,蛋白相对分子质量为68. 8 k Da,理论等电点为9. 28,脂肪系数为95. 18,亲水性系数为-0. 060,不稳定指数为40. 36,属于不稳定蛋白。生物信息学分析表明,Pvf SE具有2个跨膜结构域,无信号肽,可能定位在叶绿体或细胞质膜上,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,属于混合型蛋白。Pvf SE与西葫芦和芒柄花中参与三萜皂苷合成的鲨烯环化酶(Cp SE1,Cp SE3,Os SE1,Os SE2)亲缘关系较近。此外,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达Pvf SE的重组蛋白。结论:克隆得到Pvf SE基因,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步研究Pvf SE的功能和解析野三七中三萜皂苷生物合成途径奠定了基础。     

学《黄帝内经》辨证论治——浅谈“中风”的中医药辨证论治体会

《黄帝内经》是中医学最早,最完善的中医基础理论书籍,几千年来一直指导中医临床,特别辨证论治观点贯穿着中医学始终,有广泛的临床应用价值。中风好发于中老年人群中,临床上较为常见,多与现代医学的心、脑、血管疾病相关。适宜的中医药治疗,有着广泛的临床应用价值。     

丹参素在大鼠体内代谢产物的鉴定分析

应用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术对丹参素在大鼠血浆和尿液中的代谢产物进行鉴定。SD大鼠灌胃给药丹参素CMC-Na混悬液后,收集其血浆和尿液,应用固相萃取法进行样品前处理。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱。在电喷雾负离子模式下采集生物样品的质谱数据。根据精确相对分子质量以及多级质谱裂解信息,结合对照品及文献报道结果比对,最终鉴定了丹参素以及21个丹参素Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物,同时分析了丹参素主要的体内代谢反应,如脱水、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、去羟基化以及相关的复合反应等。该文应用高分辨液质联用技术快速阐明了丹参素在大鼠体内的代谢产物,为今后药效物质基础和作用机制研究奠定了基础。     

植物环烯醚萜类化合物生物活性研究进展

环烯醚萜类化合物是一类重要的植物次生代谢产物,具有广泛的生物活性,作者对此类化合物的分布、生物活性进行综述。总结了环烯醚萜类化合物在糖尿病治疗、保肝、抗炎、抗菌、抗肿瘤等方面的应用,为相关药用植物的开发及该类化合物在医药领域上的进一步应用提供参考。     

灯盏花素大鼠在体肠吸收动力学研究

目的 研究灯盏花素在大鼠肠道的吸收动力学。方法 进行大鼠在体肠循环灌流肠吸收实验，HPLC法测定灯盏花乙素，研究灯盏花素在小肠和结肠的吸收情况，并分别考察不同质量浓度和不同pH对小肠吸收的影响。结果胆管结扎与胆管不结扎的实验组之间，吸收速率常数（ka）和吸收百分率均有显著性差异，在小肠和结肠的ka分别为（0．1071±0．013O）和（0．0707±0．0089）h^-1；灯盏花素在不同质量浓度下，未发现饱和现象，其ka几乎保持不变，在pH6．0～7．4，灯盏花素的吸收不受pH的影响。结论 灯盏花素在小肠的吸收多于在结肠的吸收，其吸收机制为被动扩散，吸收过程为一级动力学过程，提示灯盏花素可以被制成口服缓释剂型。     

高校推进马克思主义大众化战略地图的绘制

将平衡计分卡(通过绘制战略地图)运用于高校推进马克思主义大众化这一具体实践成效的评估.在对高校推进马克思主义大众化现状和途径文献研究的基础上,提出高校推进当代中国马克思主义大众化的使命、核心价值观、愿景、战略和各层面的主要构成要素,确定高校推进当代中国马克思主义大众化的4个战略主题,且其成果主要体现为3个方面.     

硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量比较

目的：比较硫酸蒽酮法与硫酸苯酚法测定灵芝多糖含量的差异。方法：分别采用上述两种方法利用紫外可见分光光度计测定灵芝中多糖的含量。结果：利用上述两种方法分别测定同一样品灵芝多糖的含量,硫酸蒽酮法测定结果高于硫酸苯酚法。结论：两种方法均操作简便,稳定可行,较之硫酸苯酚法,药典记载的硫酸蒽酮法更加科学合理。     

蛋白质组学在中医"证"实质研究中的应用

从中医证候和蛋白质组学的特点及研究方法着手,分析了蛋白质组学引入"证"实质研究的优势与可行性,认为蛋白质组的整体性、动态性、时空性、复杂性与同样具有整体性、动态性、时相性、复杂性等特点的中医"证"有着惊人的相似,其中可能存在某种内在联系和对应关系。因此,与"证"实质研究中一般的微观指标相比,蛋白质组学有着特殊的优势,也更加符合"证"自身的特点。文章将近几年中医证候蛋白质组学的有关研究成果从技术条件、思路方法以及具体证型与蛋白质组的相关性等几个方面进行综述归纳,展示了蛋白质组学在中医"证"实质研究中的美好前景。     

代谢组学在转运蛋白的生物体内功能分析中的应用

转运蛋白是一种允许有机和无机溶质高效率和选择性跨膜透过的膜蛋白。转运蛋白基因的分子识别即通过克隆cDNA外源表达系统的体外实验方法,阐明转运蛋白的功能。代谢组学分析是通过定量比较某化合物在野生型和转运蛋白基因敲除型小鼠的尿液、血液或组织样本的信息,从而揭示生物体内转运蛋白的真正底物。这种方法也可以用来发现孤儿转运蛋白功能。举例说明基于毛细管电泳与质谱联用（CE—MS）技术,应用代谢组学分析,揭示了SLC22转运蛋白家族中一个孤儿转运蛋白的功能。     

体内外实验探究五倍子中鞣质类成分对利福平药代动力学的影响

该实验探究五倍子中鞣质类成分对利福平体内过程的影响。体外实验分别采用紫外分光光度法和HPLC,考察利福平在p H 1. 3,6. 8,人工胃液环境和人工肠液环境中的溶解性以及在上述环境加入五倍子鞣质对利福平溶解性的影响。体内实验研究大鼠分别灌胃利福平以及利福平和五倍子鞣质后利福平在大鼠体内过程并计算药代动力学参数。结果显示,利福平在人工胃液环境中随时间不断析出,6 h后近85%利福平已析出。在人工肠液环境中溶解性良好。加入五倍子鞣质后,利福平在2种环境中的浓度均有较显著下降,且在人工肠液中,利福平的浓度保持在相对平稳的水平;在人工胃液中则保持原来的下降趋势。药代动力学参数显示,与单用利福平组相比,利福平与五倍子鞣质合用组的AUC0-t和Cmax显著降低,MRT0-t显著变慢,Tmax增加1倍,生物利用度为31. 65%。实验提示,利福平在酸性环境溶解性差;利福平与鞣质合用后生物利用度下降的重要原因是利福平与鞣质的络合减小利福平在肠道的溶解度,从而影响其在肠道的吸收。所以,利福平与含鞣质丰富的中药汤剂或中成药,不宜同时服用。     

金天格胶囊对大鼠长骨干骨折愈合影响的实验研究

[目的]研究金天格胶囊对大鼠股骨干骨折愈合的影响,以及应用Micro-CT技术对骨折愈合过程中骨内微结构的观察。[方法]将40只8周龄SD雄性大鼠通过随机数字表法分为两组,分别为实验组和对照组,每组20只。分别建立股骨干闭合骨折髓内钉固定模型,术后第3天始给予相应的干预措施。每组于造模后2周及8周两个时间点各处死实验动物10只。对患肢股骨进行取材后,大体观察骨折愈合情况,通过X线对骨折愈合情况进行评分,利用生物力学实验机测量骨痂的最大载荷、最大载荷恢复率,利用Micro-CT技术计算骨痂的总体积(TV)、骨体积(BV)及骨体积分数(BV/TV%)并对骨痂进行组织形态学观察。[结果]术后2周,实验组和对照组骨折愈合X线评分没有统计学差异。Micro-CT检测结果提示,实验组的TV值高于对照组,但两者的BV及BV/TV%值没有统计学差异。两组骨痂的最大载荷和最大载荷恢复率差异无统计学意义。术后8周,两组的X线评分、TV值没有统计学差异。但实验组的最大载荷、最大载荷恢复率、BV值及BV/TV%值高于对照组,差异有统计学意义。[结论]金天格胶囊可以促进骨折愈合。主要表现在骨折早期它会促进软骨痂的形成,骨折后期加速骨痂的矿化,提高骨折愈合的力学性能。