多药耐药草绿色链球菌LuxS基因同源重组质粒的构建

目的:构建一个含有红霉素抗性基因和多药耐药草绿色链球菌LuxS基因上下游区同源序列的重组质粒,为后续进行LuxS基因敲除实验做准备。方法:设计合成引物,分别以质粒PMG36E、草绿色链球菌DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增得到红霉素抗性基因DNA片断和LuxS基因上下游序列,经双酶切反应插入pUC19质粒的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,氨苄青霉和红霉素培养基筛选。结果:红霉素抗性基因和LuxS基因两侧同源序列成功连入到Puc19质粒相应酶切位点,PCR凝胶电泳、测序结果正确。结论:成功构建多药耐药草绿色链球菌LuxS基因敲除同源重组质粒,为进一步构建LuxS突变株打下基础。     

变异链球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除.方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,最后将这3 段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选.结果:kana 基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确.结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础.     

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。     

GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建

目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒 pGLU     

变形链球菌SBR基因表达载体的构建和表达

目的 :构建可用于大肠杆菌表达系统的含变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因的表达载体。方法 :采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段 (SBR)基因插入表达载体 pcMVT7,构建重组原核表达质粒pcMVT7 SBR ,转化大肠杆菌JM 10 9(DE3 ) ,IPTG诱导表达 ,亲和层析纯化目的蛋白。结果 :经酶切鉴定及DNA序列测定 ,重组质粒 pcMVT7 SBR序列及阅读框架正确 ,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。 结论 :SBR表达载体构建成功 ,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

含增强型绿色荧光蛋白rhBMP-2基因真核表达载体的构建

目的:构建含增强型绿色荧光蛋白的重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)基因真核表达质粒。方法:采用PCR方法扩增rhBMP-2基因,并在两端添加合适的酶切位点;利用定向克隆技术将rhBMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别插入到载体pIRES的上下游多克隆位点中,两者通过IRES连接,以防止融合表达;重组的pIRES-rhBMP2-EGFP在大肠杆菌DH5α内扩增后,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明质粒构建成功。结果:通过对重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明真核表达重组质粒pIRES-rhBMP2-EGFP构建成功,开放阅读框架正确。结论:利用PCR、T/A克隆等分子生物学技术,可成功地将编码rhBMP-2的DNA片段和EGFP片段克隆到载体pIRES中,构建出重组子pIRES-rhBMP2-EGFP。     

变形链球菌F-ATP酶基因重组质粒的构建和初步分析

目的：构建用于转化变形链球菌，含有F-ATP酶基因的重组质粒。方法：采用PCR方法，以变形链球菌基因组DNA为模板，扩增F-ATP酶β亚基5′末端序列，将克隆片段与载体pVA891酶切后连接，形成重组质粒，并对变形链球菌的转化作了初步分析。结果：构建的重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和DNA序列测定，显示插入的目的片段序列正确。结论：变形链球菌目的片段与穿梭载体重组后能有效克隆，为通过同源重组特异突变变形链球菌染色体基因奠定基础。     

变异链球菌LuxS突变株的构建及其耐酸性的测试

目的:把构建好的含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒转入变异链球菌进行luxS的敲除以形成luxS突变株,同时测试变异链球菌失去luxS基因后在pH 3.0酸性环境中的生长情况.方法:把含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒(pMD-19TUKD)转化入变异链球菌UA159中,利用间源重组,等位基因交换进行luxS基因敲除,再对此突变株进行PCR的检测,利用测试A值、梯度稀释和平板计数法,对变异链球菌luxS突变株和野生型的变异链球菌在pH 3.0酸性环境下生存情况进行比较.结果:成功的构建了变异链球菌luxS的突变株,并且变异链球菌失去luxS基凶后,在酸性环境下的生存能力相对于野生型的变异链球菌低.结论:LuxS基因对变异链球菌的耐酸性起着重要作用.     

变形链球菌recA基因启动子荧光蛋白表达载体的构建

目的 构建由recA基因启动子启动的红色荧光蛋白穿梭表达载体,研究变形链球菌recA基因表达的特点,以期为不同致龋环境中变形链球菌致龋毒力因子基因的表达提供参照.方法 以变形链球菌(UA159)基因组DNA为模板,扩增recA基因启动子,采用双酶切反应连接入载体pDsRed2-N1,构建原核表达载体pRred;通过酶切重组人穿梭载体pDL276,构建红色荧光蛋白表达载体pLRred.结果 经酶切鉴定目的质粒片段插入无误,同时重组载体pLRred转化菌荧光观测结果提示,重组载体pLRred构建成功.结论 本项研究中构建的recA基因启动子红色荧光蛋白同源重组克隆载体正确,可应用于recA基因表达的研究,同时可为研究变形链球菌致龋基因的表达提供内参照.     

变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建

目的构建用于转化变形链球菌的luxS基因缺失的同源重组克隆载体。方法利用哈氏弧菌（Vibrio harveyi）BB170作为报告菌株，对变形链球菌在不同生长时期诱导生物发光的能力进行测定，然后分别PCR扩增变链菌luxS基因上下游片段及质粒PJT10的红霉素抗性基因片段，采用分子克隆技术将基因片段依次双酶切后连接人载体pUC19，构建luxS基因缺失的重组质粒，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞经筛选后，抽提重组质粒，进行酶切鉴定。结果变链菌国际标准株可诱导哈氏弧菌BB170的生物发光现象，提示变链菌中存在AI-2数量感应通路。构建的重组质粒pUCluxKO经PstI-BamHI双酶切，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带；经BamHI—KpnI双酶切，产物电泳在大约1500bp和4500bp处各见一条特异条带；经KpnI—EcoRI双酶切后，产物电泳在大约1000bp和5000bp处各见一条特异条带。结论变链菌luxS基因同源重组质粒构建成功，为进一步通过同源重组法构建变链菌luxS基因缺陷株奠定基础。     

变异链球菌自诱导物2信号分子的体外合成与活性检测

目的：利用分子生物学的相关技术体外合成具有良好生物学活性的自诱导物2（AI-2）信号分子,为进一步研究S-核糖高半胱氨酸裂解酶（LuxS）/AI-2信号系统对于变异链球菌和口腔生物膜的致病性、耐药性的调节机制奠定基础。方法???构建稳定高效的LuxS和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（Pfs）原核表达载体,异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的蛋白,并进行镍柱层析分离纯化与鉴定。利用纯化表达的LuxS蛋白和Pfs蛋白体外合成AI-2信号分子,以哈维氏弧菌菌株BB170作为报告菌株,通过生物发光效应检测体外合成的变异链球菌AI-2信号分子的生物活性,并以此间接检测LuxS蛋白和Pfs蛋白的生物学活性。结果???体外合成的AI-2可诱导哈维氏弧菌菌株BB170强烈发光。以变异链球菌UA159标准株菌液中自然生成的AI-2为对照,体外合成AI-2诱导发光效果强于菌液。结论??体外合成的AI-2具有良好的生物学活性,获得了高效表达、可溶性的LuxS和Pfs重组蛋白。     

牙龈卟啉单胞菌clpP基因缺失株和回补株的构建和鉴定

目的 构建并鉴定牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）W83的丝氨酸蛋白酶(caseinolytic protease,Clp)基因缺失株和回补株,为探索clpP基因在P.g致病过程中的作用和机制奠定基础。方法 设计clpP基因的引物对,PCR扩增其上下游同源片段,克隆入质粒pUC18中,插入红霉素抗性基因ermB作为筛选标记,构建重组质粒,电转化入P.g W83构建缺失株;PCR扩增clpP基因片段与重组质粒pUC18-ΔclpP-ermB连接,电转化入P.g W83缺失株中构建回补株。采用PCR和酶切电泳鉴定序列的正确性,利用抗性培养基筛选高表达菌株。结果 clpP基因克隆成功并顺利导入质粒pUC18中,P.g W83的clpP基因缺失株和回补株构建成功,并能在体外稳定传代。结论 本研究运用同源重组技术构建了P.g W83的clpP基因缺失株,并建立了以pUC18质粒为载体的clpP基因回补方法,为进一步研究clpP基因在P.g致病过程中的作用打下了基础。     

运动发酵单胞菌adhB基因置换变形链球菌1dh基因重组质粒的构建

目的 保留重组质粒pMDl8-T-ldh中变形链球菌ldh基因上下游同源区，用运动发酵单胞菌adhB基因置换胁基因构建重组质粒。方法 PCR法扩增adhB基因，克隆到PGEM-T载体，构建pGEMA重组质粒，以pMD18-T-1dh重组质粒为模板，反向PCR法缺失ldh，NcoI和XhoI酶产物片段和pGEMA质粒，连接得到重组质粒pMDLA。结果成功克隆adhB基因，并用该基因置换ldh基因构建重组质粒pMDLA。结论 本实验成功将反向PCR法引入缺失突变诱导，丰富了运动发酵单胞菌在医学领域的应用。     

变形链球菌葡萄糖基转移酶基因部分DNA克隆

根据变链菌ｇｔｆＢ基因序列设计一对引物，采用ＰＣＲ方法扩增其中的５３１ｂｐ的ＤＮＡ片段，纯化后通过质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（一）转化大肠杆菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ构建ｇｔｆＢ基因部分ＤＮＡ克隆，为变链菌基因检测做准备。     

LuxS基因缺失对变异链球菌生物学性状的影响

目的:观察LuxS基因突变对变异链球菌生物性状的影响。方法:将变链菌标准株和LuxS突变株分别培养于TSA、TSA-Cmr、BHI培养基培养48 h,通过菌落形态观察、常规生化检测、革兰染色涂片观察和生长曲线,比较两种菌株的生长特性;体外建立LuxS基因突变株和标准株的生物被膜模型,结晶紫染色,观察比较两菌株形成生物被膜的能力。结果:在含氯霉素的TSA-Cmr固体培养基中增塑,标准株基本不能生长,而突变株的生长状况基本正常。在不含氯霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,革兰染色镜下观察,可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。生长曲线观察发现:两菌株在生长模式上基本一致,均呈典型的"S"型曲线,只是在进入生长的稳定期后,两者在细菌饱和度上有一定差异,即11.5～22.5 h之间各时间点标准株的A值均明显高于LuxS突变株(P<0.05)。在BHI培养基中两菌株均能形成生物被膜,但结构存在差异:标准株形成光滑且均匀分布的生物被膜,而突变株的生物被膜形态较粗糙。结论:LuxS基因突变对变异链球菌的生长以及生物被膜形成能力等生物学性状有一定影响。     

多瘤病毒MT基因真核表达载体的构建

目的 :构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核细胞表达载体。方法 :从野生型多瘤病毒上取其nt46 32至nt15 6 0片段克隆到pUC19上 ,再将该片段定点插入 pEGFP1的HindⅢ和EcoRI位点间 ,构建携带多瘤病毒MT癌基因的真核表达载体 pPyMT GFP。经线性化 ,将重组体导入鼠皮肤成纤维细胞中 ,G418选择培养 ,得到抗性细胞克隆。结果 :构建的pPyMT GFP质粒在鼠成纤维细胞中有稳定表达。 结论 :来源于野生型多瘤病毒的PyMT基因在哺乳动物细胞中有稳定表达 ,其真核表达载体 pPyMT GFP可被进一步用于研究PyMT蛋白在血管瘤发生中的作用     

牙龈卟啉菌特异DNA片段的分子克隆

采用ＰＣＲ扩增Ｐｇ特异ＤＮＡ片段作为外源目的ＤＮＡ，将质粒载体ｐＵＣ１９和外源ＤＮＡ用限制性内切酶ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ消化，经过连接形成重组质粒并转化细菌后，选白色菌落进行鉴定。结果证实我们成功地获得了含Ｐｇ特异基因片段的克隆。通过将细菌增菌后就可得到取之不尽的特异ＤＮＡ片段。为研究Ｐｇ的基因结构，致病机理以及制备特异的核酸探针检测细菌奠定了基础。