HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

目的分析HPV18E2蛋白的CTL表位,合成并纯化这些表位多肽,构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞,检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果,为进一步研制人乳头瘤病毒18型（HPV18）基因工程疫苗打下基础。方法以重组质粒（pBR322-HPV18）为模板,利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段,将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒（pIRES2-EGFP）重组构建重组质粒（pIRES2-HPV18E2-EGFP）。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51^Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2-EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论三条备选肽段都具有明显的杀伤效应,均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。     

11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白表达、纯化及抗血清制备

目的 表达人乳头瘤病毒16型(HPV16) E2蛋白,并制备小鼠抗HPV16 E2血清.方法 采用PCR技术扩增HPV16E2基因,构建入pET21b载体,重组表达载体pET21 b-HPV16E2经鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达并鉴定表达产物.经纯化、变性和复性方法,制备可溶性HPV16 E2蛋白.免疫BALB/c小鼠制备抗血清,检测小鼠IFN-γ、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4/CD8比值和抗血清滴度变化.结果 酶切和测序结果表明pET21b-HPV16 E2构建成功.表达蛋白相对分子质量(Mr)为42 000,Western blot法证明具有较高特异性.小鼠抗血清效价升高,CD4+T细胞数量和CD4/CD8比值升高,小鼠IFN-γ无升高.结论 成功制备可溶性HPV16 E2蛋白和小鼠抗HPV16 E2高效价的抗血清.     

siRNA抑制HPV18 E6基因及其对HeLa细胞凋亡的影响

目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染siRNA后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

小鼠巨噬细胞内表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对细胞增殖和凋亡的影响

 目的：建立培养滤液蛋白10-早期分泌性抗原靶6（CFP10-ESAT6）真核表达质粒并转染RAW2647巨噬细胞,观察胞内表达CFP10-ESAT6对细胞活性及凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法：将CFP10-ESAT6融合基因插入真核表达质粒pEGFP-N1,构建重组质粒,转染RAW264.7巨噬细胞。采用MTT的方法测定CFP10-ESAT6融合蛋白对RAW264.7巨噬细胞活性的影响,采用结核分枝杆菌19 kD脂蛋白和十字孢碱（staurosporine）处理RAW264.7巨噬细胞,并以流式细胞术检测细胞凋亡率以及Toll样受体2（TLR2）的表达。结果：成功构建了重组质粒pEGFP-N1/CFP10-ESAT6并转染至RAW264.7巨噬细胞;与对照组相比,胞内表达CFP10-ESAT6不能影响巨噬细胞的活性,但可以明显抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡(P＜0.05),并显著抑制了TLR2的表达(P＜0.05)。结论：巨噬细胞内表达的CFP10-ESAT6融合蛋白不具有细胞毒性作用,但可以通过下调TLR2的表达来抑制结核分枝杆菌19 kD脂蛋白所造成的凋亡。     

HMGB1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬和I-A/E表达的影响

目的:探讨HMGB1对巨噬细胞免疫功能的影响.方法:梯度浓度HMGB1处理小鼠腹腔巨噬细胞, 或将小鼠随机分为生理盐水对照、 24 h和48 h高与低剂量HMGB1注射组, 腹腔注射0.2 μg或20 μg HMGB1, 或生理盐水.检测巨噬细胞吞噬功能和I-A/E表达.结果:10 μg/L HMGB1刺激6～12 h, 巨噬细胞吞噬功能较其他剂量组明显增强(P<0.05或P<0.01).HMGB1对培养巨噬细胞I-A/-E表达无影响.高剂量HMGB1攻击小鼠24 h, 其腹腔巨噬细胞吞噬能力明显降低(P<0.05); 低剂量HMGB1攻击48 h, 巨噬细胞I-A/-E表达明显上调(P<0.05或P<0.01).结论:高剂量HMGB1抑制巨噬细胞吞噬功能, 低剂量HMGB1增强巨噬细胞免疫功能.     

用于治疗尖锐湿疣的HPV6型L2△N360E7E6融合蛋白的原核表达及其免疫效果的初步评价

目的 原核表达人乳头瘤病毒（HPV）6型L2AN360E7E6融合蛋白并对其免疫效果进行初步评价.方法 用重叠PCR将HPV6b 12（1～360 bp）、E7、E6三个基因片段融合,原核表达HPV6bL2△N360E7E6融合蛋白,蛋白纯化后与Al（OH）3、CpG佐剂配伍肌内注射免疫C57BL/6小鼠,使用IFN-γ ELISPOT与ELISA分别对其细胞免疫和体液免疫效果进行评价.结果 蛋白＋CpG佐剂组与其他免疫组相比,针对E7与E6均有明显较强的细胞免疫反应;各免疫组均能检测到高滴度的抗L2的抗体,但各组之间无明显差异.结论 利用pQE30原核表达系统成功克隆、表达和纯化了HPV6bL2△N360E7E6融合蛋白,且该蛋白与合适佐剂配伍能在C57BL/6小鼠体内诱发强的细胞免疫和体液免疫反应,为该蛋白的后期研究奠定了基础.     

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1(Ipr1)基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP-C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7, 以空质粒pEGFP-C1转染组作为对照.采用RT-PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位.结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP-Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内.结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达.Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白.     

HPV16/18和HPV16E6/E7DNA在宫颈癌组织中的表达

目的检测HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA在宫颈癌组织中的表达,探讨其在宫颈癌发病中的作用.方法应用PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测46例宫颈癌组织中HPV16/18和HPV16E6/E7DNA.结果 46例宫颈癌中56.5%(26/46)扩增HPV16/18 DNA,其中宫颈鳞癌25例,宫颈腺癌1例.正常对照组20例HPV16/18DNA均为阴性,与宫颈癌组相比差异有显著性(P<0.01).HPV16/18 DNA阳性拷贝对数值为4.32±2.45.HPV16E6,E7DNA分别有53.8%(14/26)、46.2%(12/26)扩增.结论 HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA与宫颈癌的发生密切相关,是宫颈癌恶性转化的关键之一,预示着宫颈癌有较强的增殖能力和转移能力.     

The full-length E1E4 protein of human papillomavirus type 18 modulates differentiation-dependent viral DNA amplification and late gene expression

Activation of the productive phase of the human papillomavirus (HPV) life cycle in differentiated keratinocytes is coincident with high-level expression of E1E4 protein. To determine the role of E1E4 in the HPV replication cycle, we constructed HPV18 mutant genomes in which expression of the full-length E1E4 protein was abrogated. Undifferentiated keratinocytes containing mutant genomes showed enhanced proliferation when compared to cells containing wildtype genomes, but there were no differences in maintenance of viral episomes. Following differentiation, cells with mutant genomes exhibited reduced levels of viral DNA amplification and late gene expression, compared to wildtype genome-containing cells. This indicates that HPV18 E1E4 plays an important role in regulating HPV late functions, and it may also function in the early phase of the replication cycle. Our finding that full-length HPV18 E1E4 protein plays a significant role in promoting viral genome amplification concurs with a similar report with HPV31, but is in contrast to an HPV11 study where viral DNA amplification was not dependent on full-length E1E4 expression, and to HPV16 where only C-terminal truncations in E1E4 abrogated vegetative genome replication. This suggests that type-specific differences exist between various E1E4 proteins.     

正交试验在人乳头瘤病毒16型E2蛋白原核表达优化中的应用

鉴定人乳头瘤病毒(HPV)16型E2蛋白的重组表达菌株,通过正交试验快速优化诱导表达条件,增加目的蛋白的表达量。应用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达后的蛋白。选取诱导时间、诱导剂浓度、细菌密度OD600和诱导温度共4个主要外部因素。采用四因素两水平正交试验设计,以单位体积内HPV16 E2目的蛋白含量作为检测指标,结果用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果表明,HPV16 E2菌株鉴定正确。HPV16 E2蛋白表达主要以不溶性蛋白为主,主要影响因素是诱导剂浓度和诱导温度,最佳诱导条件为37℃、1.0 mmol/L IPTG和OD600为1.0的条件下诱导7 h,正交试验对分子生物学反应的影响因素分析和条件优化有借鉴意义。     

Gene expression profiles reveal an upregulation of E2F and downregulation of interferon targets by HPV18 but no changes between keratinocytes with integrated or episomal viral genomes

Persistent infections with human papillomaviruses type 18 can result in the development of cervical cancer. HPV18 genomes persist extrachromosomally in low-grade and precancerous lesions but are always integrated in cervical cancers, and this might contribute to the progression of HPV18-induced lesions. To address whether integration induces additional changes in host cells, several keratinocyte lines with wild type and replication-deficient E1 mutant HPV18 (E1C-TTL) genomes were analyzed with high density oligonucleotide arrays. In comparison to normal keratinocytes, wild type and integrated E1C-TTL HPV18 genomes deregulate the expression of 280 annotated genes. However, the comparison of wild type with E1C-TTL cell lines did not reveal any significant differences, indicating that neither the loss of E1 nor viral integration induces additional gene expression changes in low passage HPV18-positive keratinocytes. Half of the deregulated genes have been described as targets of the p16/Rb/E2F, p53, interferon or NFkappaB pathways consistent with the functions ascribed to the viral E6 and E7 oncoproteins, but the other half can currently not be ascribed to certain pathways.     

人乳头状瘤病毒18型E6E7基因诱导胎儿食管永生化上 …

目的 ＳＨＥＥ细胞系是经人乳头状瘤病毒（ＨＰＶ）１８型Ｅ６Ｅ７基因诱导的永生化上皮细胞株,已传代超过５０代。研究胎儿食管上皮永生化的细胞 ＳＨＥＥ生物学特性,包括增殖,分化和调亡。方法 细胞于１９９培养基培养,用光镜、电镜和荧光显微镜研究其生长率、形态和染色体分析;用流式细胞仪研究其细胞增殖动力学;用免疫组织化学方法研究Ｋｉ６７和角蛋白和用末端转移酶标记（ＴＵＮＥＬ）凋亡细胞。结果 细胞培养呈单导     

DNA virus oncoprotein HPV18 E7 selectively antagonizes cGAS-STING-triggered innate immune activation

Cellular infections by DNA viruses trigger innate immune responses mediated by DNA sensors. The cyclic GMP–AMP synthase (cGAS)-stimulator of interferon gene (STING) signaling pathway has been identified as a DNA-sensing pathway that activates interferons in response to viral infection and, thus, mediates host defense against viruses. Previous studies have identified oncogenes E7 and E1A of the DNA tumor viruses, human papillomavirus 18 (HPV18) and adenovirus, respectively, as inhibitors of the cGAS-STING pathway. However, the function of STING in infected cells and the mechanism by which HPV18 E7 antagonizes STING-induced Interferon beta production remain unknown. We report that HPV18 E7 selectively antagonizes STING-triggered nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) activation but not IRF3 activation. HPV18 E7 binds to STING in a region critical for NF-κB activation and blocks the nuclear accumulation of p65. Moreover, E7 inhibition of STING-triggered NF-κB activation is related to HPV pathogenicity but not E7–Rb binding. HPV18 E7, severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 open reading frame 3a, human immunodeficiency virus-2 viral protein X, and Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus KSHV viral interferon regulatory factor 1 selectively inhibited STING-triggered NF-κB or IRF3 activation, suggesting a convergent evolution among these viruses toward antagonizing host innate immunity. Collectively, selective suppression of the cGAS-STING pathway by viral proteins is likely to be a key pathogenic determinant, making it a promising target for treating oncogenic virus-induced tumor diseases.