海南三亚红树林放线菌多样性及抗菌活性

目的 研究海南三亚红树林底泥样品中放线菌的多样性及抗菌活性,以期发现可以产生新颖活性物质的药用放线菌资源。方法 采用11种分离培养基以稀释涂布法对样品中的放线菌进行选择性分离;对分离菌株的16S rRNA基因序列进行扩增、比对,开展多样性分析;放线菌发酵液经乙酸乙酯萃取,采用纸片法对粗提物进行抗菌活性筛选;同时对放线菌的生物合成基因NRPS、PKS I和PKS II进行筛选。结果 共分离到149株放线菌,它们分布于6个目12个科16个属,其中小单孢菌属为优势菌属;菌株MG16072的16S rRNA基因序列与最近有效菌株Actinomadura hallensis H647-1T的相似率为97.94%,为潜在Actinomadura属新种;抗菌活性检测结果显示,有20株放线菌至少对1株检定菌具有抗菌活性;NRPS、PKS I、PKS II基因筛选结果显示,有82株放线菌至少含有1种生物合成基因。结论 海南三亚红树林含有丰富的药用放线菌资源,具有从中发现新颖活性物质的潜力。     

锡林郭勒盟高原盐湖放线菌资源勘探及抗菌活性筛选

摘要：目的 探究锡林郭勒盟高原盐湖放线菌的多样性、新颖性及抗菌活性,为新型抗菌活性产物的发掘储备菌种资源。方 法 采用20种分离培养基,以平板涂布法分离放线菌;依据16S rRNA基因的同源性对菌株进行分子鉴定;PCR检测代表菌株的I型聚 酮合酶(PKS I)、II型聚酮合酶(PKS II)和非核糖体多肽合成酶(NRPS)功能基因;菌株的发酵液上清和菌体分别经乙酸乙酯和丙酮提取, 提取样品经纸片扩散法进行抗菌活性检测。目标菌株合成次级代谢产物的能力通过antiSMASH对基因组序列进行分析预测。结果 从 7份盐湖土壤样品中分离获得了365株放线菌,其分布于放线菌纲的8个目15个科28个属,优势菌属为链霉菌属和拟诺卡菌属。分离获 得的链霉菌新颖性突出,13株链霉菌与近缘菌株16S rRNA基因的最高相似度≤98.0%,推测其归属于10个链霉菌属新种。受试放线菌 对革兰阳性菌的抗菌活性显著,并从中筛选出3株抗菌作用强且抗菌谱较广的链霉菌;20株受试放线菌同时含有3种抗生素生物合成基 因。菌株XMNu-295基因组含有24个潜在的次级代谢产物生物合成基因簇,以聚酮类、非核糖体多肽类和萜烯类等为主。结论 锡林 郭勒盟高原盐湖中可培养放线菌多样性较为丰富,新颖性突出,目标菌株值得进一步开展次级代谢产物的化学研究。     

芳香聚酮类化合物产生菌的分子筛选及其代谢产物的研究

目的 建立一种芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法并获得相应结构类型的化合物.方法 依据芳香聚酮类化合物生物合成途径所用的Ⅱ型酮基合酶的同源性设计简并引物,通过PCR方法扩增出约0.6kb目的基因片段,同时通过同源进化和抗菌活性分析对海洋放线菌是否产生芳香聚酮类化合物进行早期评估,并最终从阳性菌中分离得到相应结构类型的化合物.结果 利用建立的芳香聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对100株海洋放线菌进行筛选,获得了18株携带Ⅱ型酮基合酶基因的阳性菌株,通过同源进化和抗菌活性分析后从中筛选到1株与多环氧杂蒽酮类化合物lysolipin和xantholipin的酮基合酶基因同源的野野村菌(Nonomuraea sp.)FIM02-765,并最终从该菌中分离得到多环氧杂葸酮类化合物simaomicin α.结论 本研究通过聚酮合酶编码基因的同源进化分析以及建立起来的Ⅱ型酮基合酶基因与化合物之间的联系,验证了芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法的可行性,同时本文还首次从野野村菌(Nonomuraea sp.)中分离得到多环氧杂葸酮类化合物simaomicin α,这些都为高效利用海洋放线菌资源和基因资源奠定了一定的基础.     

广西茅尾海红树林根围淤泥放线菌多样性及抗菌活性

目的 对广西茅尾海红树林保护区植物根部淤泥中的放线菌进行分离鉴别,研究放线菌的多样性和抗菌活性。方法 选用10种分离培养基,经稀释涂布法分离放线菌;通过PCR扩增,测序后获得菌株16S rRNA基因序列;邻接法构建系统发育树并进行同源性分析,探测放线菌的多样性;针对发酵液经乙酸乙酯萃取后的有机相、水相及菌丝丙酮浸泡液共3类样品,采用纸片扩散法开展抗菌活性研究。结果 从8份红树林植物根围淤泥样品中分离纯化得到244株放线菌,分布于5个目13个科29个属,优势菌属为链霉菌属和小单孢菌属;16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的放线菌共有4株,可能为潜在新物种;抗菌活性筛选结果表明,83株放线菌的抗菌活性阳性率达71.1%。结论 广西茅尾海红树林保护区植物根围淤泥中抗菌活性放线菌的多样性丰富。     

红树林放线菌多样性及新型糖苷类化合物合成潜力发掘

目的从红树林海泥中分离放线菌,探讨其多样性;并对分离菌株合成新型糖苷类化合物的代谢潜力进行评估和发掘。方法利用3种培养基进行菌株分离,对排重后菌株进行16SrDNA序列多样性分析;对分离菌株进行糖基转移酶基因筛选,对阳性菌株进一步进行合成潜力的评估及抗肿瘤活性的筛选。结果分离纯化得到148株红树林放线菌,分布于链霉菌属(Streptomyce)的54个种、原小单胞菌属(Promicromonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)和诺卡氏菌属(Nocardia)。3株菌株有合成新型糖苷类次级代谢产物的潜力并均表现出较好的抗肿瘤活性。结论红树林土壤蕴含丰富的放线菌资源和合成活性次级代谢产物的潜力,是新药开发和天然活性产物的重要来源。     

海洋细菌中活性化合物的筛选策略

目的 从700多株海洋沉积物分离得到的细菌中筛选安莎类抗生素和6-脱氧己糖(6DOH)糖基化修饰的次级代谢产物产生菌.方法 以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合酶基因和dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因为靶标,分别进行安莎类抗生素和6DOH糖基化修饰的次级代谢产物产生菌的分子筛选.对AHBA合酶及dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性的菌株发酵液及提取物进行抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性分析.采用利福霉素抗性及氢氧化钠显色初步鉴定安莎类化合物;采用α-萘酚硫酸显色初步鉴定6DOH糖基化修饰的化合物.利用16S rRNA序列对部分阳性菌株进行系统发育分析.结果 共获得39株AHBA合酶基因阳性和10株dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株.阳性菌株中,78%具有不同程度的生物活性.化学初步鉴定结果表明:49%的AHBA合酶基因阳性菌株产生安莎类化合物:50%的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株产生6DOH糖基化修饰的化合物.系统发育分析表明,大多数阳性菌株属于放线菌中的链霉菌属.结论 基因探针筛选可作为一种合理、有效的方法从海洋细菌中发现活性代谢产物.     

广西北仑河口红树林植物根际淤泥放线菌的分离、鉴定、多样性及抗菌活性研究

从红树林根际淤泥中分离鉴定放线菌并进行多样性分析及抗菌活性研究,为新抗生素的发现提供药用放线菌资源。方法 用6种分离培养基,利用涂布平板法分离放线菌;通过PCR扩增获得菌株16S rRNA基因并进行同源性比对,分析放线菌多样性;发酵液经处理分别形成发酵液酯相、发酵液水相和菌丝丙酮浸提液3类样品;纸片扩散法进行抗菌活性测试。结果 从5份红树林植物根际淤泥样品中分离纯化得到56株放线菌,分布于7个目7个科12个属,优势菌属为小单孢菌属和红球菌属;菌株L9T122、L1T1Jb1的16S rRNA基因序列与有效发表菌株Agromyces bracchium IFO 16238T(AB023359)、Streptomyces radiopugnans R97T(DQ912930)的相似率最高,分别为97.49%和97.07%,为潜在壤霉菌属和链霉菌属新种;抗菌活性检测结果表明,在20株放线菌中,15株具有抗菌活性,总阳性率为75.00%。其中L2T1Gb21、L9T122对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有较强的抑菌作用。结论 广西北仑河口红树林植物根际土壤中含有较为丰富的放线菌资源,菌株L2T1Gb21、L9T122有较强的抗菌活性,具有开发抗菌新药的潜力。     

角果木树皮来源放线菌多样性及生物活性初探

摘要：勘探红树植物角果木树皮来源放线菌多样性,挖掘具有高效广谱抗农用真菌、高产多种功能酶和一定耐药性的放线 菌,为开发农用生防菌肥提供参考依据。应用可培养技术和16S rRNA基因序列的系统发育分析研究红树植物角果木中可培养放 线菌的多样性,并对其进行抑制植物病原菌、功能酶活性及其基因组DNA的聚酮合酶(PKS)基因与非核糖体肽合成酶(NRPS)基 因筛选;同时对抑菌活性菌株开展有机磷农药耐受试验。结果表明,从角果木树皮中共分离到30种放线菌,隶属于10科12属; 从中筛选出10株放线菌在至少1个抗菌活性检测中显示阳性,且对多种有机磷农药均表现出一定的耐受性;此外,其中24株放 线菌具有至少一种功能酶活性,及18株放线菌的基因组DNA扩增出抗生素生物合成基因。综上所述,海南东寨港红树林保护区 内红树植物角果木树皮来源放线菌具有丰富的物种多样性和多种显著的生物活性。     

一株黄独内生放线菌活性研究及抗生素生物合成潜力的筛查

对一株分离自药用植物黄独的内生菌放线菌LCB-A281进行系统学鉴定,并研究其发酵产物的抑菌活性、抗肿瘤活性及抗糖尿病活性,最后再筛查其抗生素生物合成潜能.根据其形态特征、培养特征、生理生化特征、16S rRNA基因测序及系统发育分析结果,可将菌株LCB-A281确为Streptomyces sp..抑菌及抗肿瘤活性测试发现,该菌株对5株供试细菌均有明显的抑制作用,对肝癌细胞株HepG2也具有极强的抑制效果,表明LCB-A281具有较强的广谱抗菌活性和极强的细胞毒活性.抗生素生物合成基因的PCR筛查结果显示,NRPS和PKS-Ⅱ的基因筛查均呈阳性,可推知该菌株具有在筛选抗生素生产候选菌株方面的潜力.     

罗布泊地区沙生植物根际放线菌多样性及生物活性的研究

目的研究罗布泊地区沙生植物根际放线菌多样性及其生物活性,以期发现新药用微生物资源。方法采用2种分离方法,6种分离培养基,从两种沙生植物24份根际土样中分离放线菌;对其中131株放线菌发酵液及乙酸乙酯提取液采用抗菌、杀线虫模型进行活性筛选,并根据活性测定结果结合菌株形态特征对其中66株进行16S rRNA基因序列分析。结果共分离到放线菌154株,53株在其中一个或两个活性筛选模型中都显示为阳性,总阳性率为40.46%,16S rRNA基因序列分析表明这66株放线菌分布在12个属,除了优势菌链霉菌(Streptomyces)外,还发现了拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis),拟无枝酸菌属(Amycolatopsis),疣孢菌属(Verrucosispore),喜冷杆菌属(Cryobacterium),异壁放线菌属(Actinoalloteichus),假诺卡氏菌属(Pseudonocardia),普氏菌属(Prauserella),链单孢菌属(Streptomonospora),贫养杆菌属(Modestobacter),放线产孢菌属(Actinomycetospora),芽生球菌属(Blastococcus)等稀有放线菌属,菌株CA15-2与GenBank数据库中最近种Nocardiopsis nikkonensis YU1183-22T(GenBank登录号:AB491226)的相似性约为94%,可能为潜在的新属或新种。结论罗布泊地区沙生植物根际存在较为丰富的放线菌资源并能产生多种活性次级代谢产物,值得进一步的研究。     

茅尾海桐花树根际土壤来源几丁质降解菌株多样性及抗植物真菌活性的研究

摘要：目的 以胶体几丁质为唯一碳源的培养基,从广西茅尾海红树林桐花树根际土壤中分离几丁质降解菌株,并应用复 筛培养基筛选产几丁质酶菌株,结合平板对峙法挖掘能高效抑制植物病原真菌生长的活性菌株,为红树林来源微生物农用生物 防治药物的研发奠定基础。方法 采用平板稀释涂布法和划线法分离纯化菌株,并应用复筛培养基通过透明圈观察法检测菌株 几丁质酶活;采用Chelex-100法提取菌株基因组DNA,通过PCR扩增菌株的16S rRNA基因序列,上传至EzBioCloud数据库进行 在线比对;采用平板对峙法筛选抗植物病原真菌的活性菌株;采用PKS和NRPS基因的扩增引物分别检测基因组聚酮合酶基因与 非核糖体肽合成酶基因。结果 从桐花树根际土壤中分离获得28株几丁质降解菌,隶属于10目10科17属;其中5株几丁质降解 菌对4种植物病原真菌均显示出抑菌活性,抑菌活性阳性率为17.86%;并在17株几丁质降解菌中检测到抗生素生物合成基因。 结论 广西茅尾海红树林桐花树根际土壤来源的细菌及放线菌是重要的几丁质酶菌种资源,它们在抗植物病原真菌方面表现出 良好的应用潜力,在新型绿色海洋生物农药、新颖结构海洋药物及其他高赋值产品开发和利用方面具有应用前景。     

产生大环聚酮类天然产物放线菌的分子筛选研究

目的 建立一套简便、快速、高效的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系，为聚酮类药物筛选搭建一个新的技术平台；认识PKS—I基因在不同环境放线菌群中的分布规律，为新药筛选中微生物资源的定向分离提供依据。方法 通过对大环聚酮类化合物生物合成途径所用的I型聚酮合成酶氨基酸和核苷酸序列的同源性比较分析，设计了一对引物用于扩增KS／AT功能域约1．6kb目的基因片段，依据放线菌基因组中I型PKS合成酶基因的存在与否标定可能的大环聚酮类天然产物产生菌。结果 利用建立的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对98株嗜碱放线菌、99株链霉菌、46株嗜盐放线菌和757株稀有放线菌进行了筛选，研究表明嗜碱放线菌、链霉菌、嗜盐放线菌和稀有放线菌I型聚酮合成酶基因的阳性率分别为26．5％、20．4％、15．2％和9．35％。结论 利用组合放线菌基因组DNA快速提取技术和PKS—I基因兼并引物PCR扩增技术建立了快速、简便、高效的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系；并对不同环境条件的放线菌菌群的PKS—I基因分布进行了研究，结果 不仅表明了放线菌PKS I聚酮合成酶分布的广泛性，而且表明极端环境放线菌，尤其是嗜碱放线菌是大环聚酮类化合物潜在的丰富资源，为新药筛选有效菌源的确定提供了可靠依据。     

产生芳香环聚酮类天然产物放线菌的分子筛选研究

目的建立一套简便、快速、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系，为聚酮类药物筛选搭建一个新的技术平台；认识PKS—Ⅱ基因在不同环境放线菌群中的分布规律，为新药筛选中微生物资源的定向分离提供依据。方法通过对芳香环聚酮类化合物生物合成途径所用的Ⅱ型聚酮合酶氨基酸和核苷酸序列的同源性比较分析，设计一对简并引物且以微波炉法提取的基因组DNA为模板扩增KS／CLF功能域约0．8kb目的基因片段，依据放线菌基因组中Ⅱ型PKS合酶基因的存在与否标定可能的芳香环聚酮类天然产物产生菌。结果利用建立的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对99株嗜碱放线菌、100株链霉菌、47株嗜盐放线菌和776株一般放线菌进行了筛选，研究表明链霉菌、嗜碱放线菌、嗜盐放线菌和一般放线菌Ⅱ型聚酮合酶基因的阳性率分别为54％、29．3％、25．5％和24．1％。结论组合放线菌基因组DNA快速提取技术和PKSⅡ基因简并引物PCR扩增技术建立了快速、简便、高效的芳香环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系并对不同环境条件的放线菌菌群的PKSⅡ基因分布进行了研究。结果表明放线菌PKSⅡ聚酮合酶分布具有广泛性；而且同时表明链霉菌是芳香环聚酮类化合物的最丰富来源；在极端环境放线菌中，嗜盐放线菌的PKSⅡ基因在中度嗜盐放线菌分布的频率远高于嗜盐放线菌，嗜碱和中度嗜盐放线菌也是芳香环聚酮类化合物潜在的丰富资源。本研究为新药筛选中新的有效菌源的确定提供了可靠依据。     

两种Actinobacteria鉴定方法的比较

Actinobacteria classis nov.一般包括具有超过50%G C的DNA碱基组成的微生物。其中的一些菌种在生物技术和医药方面具有重要的意义。为了分离能产生有用物质的新型微生物,我们扩大了分离对象,从以前的Streptomyes和Streptomyces以外的放线菌扩大到所有的Actinobacteria。本论文试验中的Acti-nobacteria将特指那些具有普通细菌形态的高G C含量革兰氏阳性细菌。为了能够将Actinobacteria和勘察革兰氏阳性低G C含量细菌加以区分,我们建立了两种鉴定方法。一种是荧光原位杂交（FISH）方法,它具有准确和直观的优点。另外一种是PCR方法,因在Actinobacteria 23S rRNA基因的domainⅡ（螺旋区54a）有1个大约100个碱基的稳定插入片段,通过体外PCR扩增23SrDNA片段,并用琼脂糖电泳分析,可以简便地鉴定Actinobacteria。     

台湾海峡海洋沉积物放线菌的多样性

目的探究台湾海峡海洋沉积物中放线菌的多样性及发现合成药物先导化合物的新菌源。方法采用6种选择性培养基分离15份来自台湾海峡沉积物样品中含有的放线菌。挑选不同培养特征的放线菌进行初步分类鉴别、16S rRNA基因序列系统进化分析及基于PCR的烯二炔抗生素基因筛选。结果共分离到497株放线菌,挑选的95株放线菌分别属于放线菌7个科,11个属。16S rRNA基因序列分析结果提示分离到的小单孢菌科菌种存在数个潜在新种,95株菌中有27%的菌株含有烯二炔抗生素核弹头的生物合成基因片段。结论海洋环境蕴含丰富的放线菌资源,具有产生烯二炔类抗生素的潜能。     

一种新的快速简便的抗肿瘤药物筛选模型

本研究利用DNA修复缺陷的大肠埃希氏菌343/591和正常的大肠埃希氏菌343/636的差异性DNA修复特性,建立了液体悬浮法和琼脂固体筛选方法,用于抗肿瘤药物的筛选。这两种方法简单易行,其中琼脂固体筛选方法与抗生素生物鉴定杯碟法一样简单,适合于大量筛选各种来源的抗肿瘤药物。     

一种快速筛选抗菌活性海洋真菌的方法

摘要：目的 建立一种快速筛选抗菌活性真菌菌株的方法 方法 设计并改良了一种双层琼脂板快速筛选方法 结果 利用改良双层琼脂板筛选法，从一批真菌中快速筛选获得一株具有显著抗菌活性的菌株WZXY-33-10，并通过现代色谱学及波谱学方法从其发酵物中分离鉴定了2个抗菌活性化合物equisetin（1）和epi-equisetin（2）。结论 改良双层琼脂板筛选法可以作为一种快速发现抗菌活性海洋真菌的方法。     

新型Actinobacteria荧光原位杂交(FISH)探针的设计和应用

Actinobacteria是形态上变化各异的 ,具有超过 5 0 % G C的 DNA碱基组成的 ,革兰氏染色呈阳性的微生物 ,放线菌是 Actinobacteria的一个组成部分 ,它们可产生丰富的次级代谢产物。目前 ,临床上使用的抗生素中有三分之二来自于放线菌。具有普通细菌形态的 Actinobacteria由于和放线菌具有相近的共同祖先 ,可能会具有一些其它的共性 ,是目前药物筛选中一个新的研究对象 ,但很难用形态观察的方法将之和其它细菌加以区分。本论文利用此类微生物 16 Sr RNA基因同源性 ,设计了两个探针 PA- 1、PA- 2并运用荧光原位杂交方法进行 Actinobacteria的鉴定 ,G C含量测定结果表明 ,这两个探针联合使用可直观、正确地鉴定 Acti-nobacteria。