丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

慢性髓细胞白血病相关蛋白CMLAP的基因克隆化研究

目的了解慢性髓细胞白血病(CML)基因表达谱的规律,并对在CML中特异性高表达的一个新基因进行克隆、分析与鉴定。方法应用基因表达谱芯片技术,比较CML患者和正常人外周血单个核细胞(PBMC)基因的表达差异。检索核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt),对差异表达的基因进行生物信息学分析,与已知功能基因序列进行同源性比较。根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因序列,据此设计并合成该基因序列的特异性引物,提取CMLPBMC的总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果在CML患者PBMC中克隆一个新的基因,经测序证实,其编码序列全长为1872个核苷酸(nt),编码产物由624个氨基酸残基(aa)组成,命名为CMLAP。在GenBank中注册,注册号为AY762229。结论基因表达谱芯片技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了在CML中高表达的新基因CMLAP,为进一步研究CML发生发展的分子生物学机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

利用套叠PCR技术合成人胰岛素原基因的临床研究

目的设计并分子克隆适宜于大肠杆菌表达系统的人胰岛素原基因。方法以美国国家基因库（GenBank）发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性以及所用表达载体（pGEX-3x）的特点,经计算机分析、设计人胰岛素原基因为8个寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术体外延伸获得完整的人胰岛素原基因,分子克隆后测定所得基因的核苷酸序列。结果经限制性内切酶分析确定为重组克隆的质粒进行核苷酸序列分析,结果表明,我们所克隆的基因序列完全符合我们先前的设计。结论SOE-PCR技术可用于体外寡核苷酸片段的延伸并获得完整长度的基因。TaqDNA聚合酶延伸反应前以Klenow片段处理可提高较短覆盖末端或较低专一性末端正确延伸的成功率。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5''''端调控序列功能分析

目的克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。     

青少年特发性脊柱侧凸疾病候选基因SH3GLl外显子序列比对分析

目的 通过对候选基因SH3GL1的核酸序列进行比对分析,确定其是否为青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的致病基因.方法 采取以家系为基础的"病例同胞对"研究方案,提取基因组DNA,根据候选基因SH3GL1核酸序列,以10个外显子为重点设计引物对.进行PCR扩增、克隆和测序,用GeneTool软件对外显子测序结果进行序列比对分析,判断是否存在碱基变异,并进行蛋白质结构预测分析.结果 候选基因SH3GL1中的10个外显子成功地在AIS"同胞对"基因组DNA中得到扩增和克隆,且序列测定均取得阳性结果.通过比对分析,在SH3GL1的10个外显子中共发现12处碱基变异,分别位于第2(3处)、4、5(4处)、6、8和10(2处,非编码区)六个外显子上.其中先证者mRNA第515位碱基如果为T,则形成终止密码子,导致蛋白阅读框发生改变,蛋白质序列预测分析显示编码截短蛋白,从而影响蛋白质的一级结构.结论 SH3GL1是AIS的致病基因之一.     

重组梅毒螺旋体表位抗原及多表位嵌合抗原研究

目的 :为梅毒检测试剂提供抗原性强、特异性高的重组表位抗原和多表位嵌合抗原。方法 :对梅毒螺旋体的主要抗原蛋白TpN15 ,TpN17,TpN44 .5和TpN47的优势抗原表位进行计算机分析 ,从中选取具有强抗原性的表位。根据大肠杆菌的偏性密码子 ,推断出这些抗原表位的基因序列 ,采用化学合成法合成表位抗原基因并克隆表达。结果 :获得了梅毒各抗原蛋白的优势抗原表位 ,构建了各表位基因及多表位嵌合基因的表达质粒 ,在E .coli中获得了高效表达。用获得的重组蛋白质纯品 ,对 12 2份心磷脂测定阳性血清样品进行测定 ,证明重组梅毒表位抗原和多表位嵌合抗原具有预期的抗原活性。结论 :重组梅毒表位抗原及多表位嵌合抗原具有较好的抗原活性 ,可用于研究不同类型的梅毒检测试剂     

外源性PTEN基因体外转染C6胶质母细胞瘤株及稳定表达蛋白产物的鉴定

目的 探讨外源性PTEN抑癌基因转染胶质母细胞瘤株并表达活性蛋白产物的可行性.方法 对获赠的包含有人PTENcDNA全长序列的PRK-PTEN质粒进行扩增和酶切鉴定后,用脂质体介导PRK-PTEN质粒转染大鼠C6胶质母细胞瘤株,荧光染色检测转染细胞中PRK-PTEN质粒携带的绿色蛋白荧光报告基因,免疫组化染色鉴定稳定转染后C6细胞中PTEN功能蛋白.结果 转染后的C6胶质母细胞瘤株稳定表达绿色荧光蛋白和PTEN功能蛋白.结论 PRK-PTEN质粒载体在脂质体的介导下可以将PTEN基因整合到C6胶质母细胞瘤的基因序列中去,并且通过宿主基因序列的表达稳定地产生PTEN功能蛋白,为以PTEN基因为靶点的胶质瘤基因治疗提供了实验理论依据.     

人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达1 刘士辉,王国力,黄君健 等.鼠抗人纤维蛋白抗体 Fv 片段的三维结构模建.军事医学科学院院刊,1997,21(2):1202 王 翔,俞炜源.多菌落分组 P C R 法从高背景中筛选重组子.军事医学科学院院刊,1996;20(4):2333 Kutem ri

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序列设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列,然后在化学合成 １４ 条人源化单链抗体基因片段的基础上,利用二次 Ｐ Ｃ Ｒ 方法构建完整的人源化单链抗体基因,并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上,利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因,并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达。结果：构建并挑选到序列正确的全长人源化单链抗体基因,而且在大肠杆菌中实现了目的基因的高表达。结论：基因的部分化学合成, Ｐ Ｃ Ｒ构建及表达筛选是克隆基因的一种有效方法。     

人宫颈癌HPC2基因的克隆及其原核和真核表达载体的构建

目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。     

CD 151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA-Lentivector载体连接得到LV-CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV-CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151 RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×108ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点

目的：检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性，探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点，从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索。方法：采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT基因第2内含子多态性VNTR片段，克隆并鉴定，以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验，以确定该片段是否存在蛋白结合位点。结果和结论：hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点，该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物，蛋白结合的关键位点处于42bp重复单元c端的典型E-box基序(CACGTG)，但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元。此外，利用第6内含子内上游的VNTR(VNTR6-1st)的重复单元做为探针，结果发现该38bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合，从而提示了不同VNTR序列功能的多样性。     

利用T─载体克隆法对人脑源性神经营养因子全长基因PCR产物的克隆

利用Ｔ－载体克隆法完成了含信号肽及前导肽的人脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）全长基因ＰＣＲ产物的克隆。序列测定结果表明，所克隆的人ＢＤＮＦ基因从起始密码子ＡＴＧ到终止密码子ＴＡＧ的７７４ｂｐ中，除下游端ＰＣＲ引物因为采用猪的ＰＣＲ引物而有一个碱基改变外，其它序列与国外文献报道序列完全一致。该碱基改变不影响氨基酸序列     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的：研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征。方法：通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因，用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA；将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1，用脂质体介导转入CHO细胞，确定其亚细胞定位。结果与结论：基因msid2的cDNA全长1353bp，编码450个氨基酸，定位于小鼠16号染色体，其基因组全长16kb，包括14个外显子和13个内含子。亚细胞定位试验结果初步表明，该蛋白定位于内质网及质膜。RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达，而在其他组织表达水平较低。     

ErbB4基因miRNA干扰质粒的构建和有效性鉴定

目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。     

ErbB4基因miRNA干扰质粒的构建和有效性鉴定

目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。