肥大细胞脱颗粒对载脂蛋白E基因敲除小鼠斑块稳定性的影响

目的 探讨肥大细胞脱颗粒对颈总动脉套环的载脂蛋白E基因敲除小鼠斑块稳定性的影响.方法 40只雄性载脂蛋白E基因敲除小鼠予以高脂高胆固醇饲料喂养,行右颈总动脉套环术,术后4周,随机分为实验组和对照组,实验组小鼠腹腔注射肥大细胞脱颗粒剂--化合物48/80(0.5 mg/kg),对照组小鼠腹腔注射相同体积的溶媒D-Hank's,隔日一次,共4次.第4次注射后30 min安乐死,取材.比色法测定血清类胰蛋白酶活性;甲苯胺蓝染色检测肥大细胞脱颗粒;苏木素-伊红染色观察颈总动脉病理改变及斑块内出血;Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色检测斑块内新生血管密度;血管内皮钙粘蛋白、白细胞介素1β免疫组织化学染色检测其在斑块内的表达量.结果 实验组套环侧颈总动脉内膜下斑块内泡沫细胞、细胞外脂质及炎性细胞较对照组明显增多;实验组肥大细胞脱颗粒、血清类胰蛋白酶活性、斑块内新生血管密度、斑块内出血、斑块内白细胞介素1β及血管内皮钙粘蛋白的表达量比对照组显著增高(P<0.05或P<0.01).结论 肥大细胞脱颗粒增加斑块内泡沫细胞、细胞外脂质及炎性细胞,并促进斑块内血管新生、斑块内出血及白细胞介素1β和血管内皮钙粘蛋白的表达,从而使斑块稳定性削弱.     

Compound48/80对载脂蛋白E基因敲除小鼠颈总动脉套环诱导斑块的影响

目的采用肥大细胞脱颗粒剂———Compound 48/80作用于颈总动脉套环的载脂蛋白E基因敲除小鼠,以探讨肥大细胞脱颗粒对动脉粥样硬化斑块的影响及其可能作用机制。方法载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂高胆固醇饲料喂养,行右颈总动脉套环术后分为实验组和对照组,分别腹腔注射Compound 48/80或D-hank’s。第4次注射后30 min,安乐死,取材。全自动生物化学分析仪测定血清中脂质含量,比色法测定血清中类胰蛋白酶活性,苏木素—伊红染色观察颈总动脉病理改变,甲苯胺蓝肥大细胞染色,免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白和巨噬细胞特异性抗原在斑块内的表达。结果Compound 48/80对血清脂质水平无明显影响。Compound 48/80明显刺激肥大细胞脱颗粒(80.6%±17.8%比13.5%±4.1%,P<0.01),升高血清中类胰蛋白酶活性(0.57±0.13 u/L比0.36±0.10 u/L,P<0.05)。套环能加速颈总动脉斑块形成(未套环侧颈总动脉斑块面积均为0,套环侧颈总动脉均有斑块形成),Compound 48/80增大套环侧颈总动脉斑块最大横截面积(58 500±7 500μm2比8 600±2 800μm2,P<0.01),并使管腔最大狭窄程度加重(81%±15%比41%±12%,P<0.05)。Compound 48/80使颈总动脉斑块内α平滑肌肌动蛋白表达量增加(1 219±364 iu比522±137 iu,P<0.05)和巨噬细胞特异性抗原表达量增加(426±133 iu比169±38 iu,P<0.05)。结论套环能加速载脂蛋白E基因敲除小鼠颈总动脉斑块形成。Compound 48/80使套环侧颈总动脉斑块最大横截面积和颈总动脉最大狭窄程度增加,其机制可能与其刺激肥大细胞脱颗粒促使平滑肌细胞增殖和巨噬细胞聚集有关。     

下调PAI对HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物和尿激酶纤溶酶原激活物的影响

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)的发卡样小干扰RNA(siRNA)真核表达载体对人肝癌HpG2细胞组织型纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶PA(uPA)表达的影响。方法设计短发夹状PAI siRNA的寡核苷酸链,将其插入到真核细胞表达载体pSilencerTM 2.1-U6 neo载体中构建重组载体后,采用脂质体转染方法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA和蛋白对tPA和uPA表达的影响。结果转染后细胞中PAI含量降低,tPA和uPA的表达减少(均P<0.01)。结论测序结果表明发卡样的PAI siRNA真核表达载体转染HpG2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达,PAI siRNA能有效阻断PAI的蛋白合成,同时抑制细胞中tPA和uPA的表达。     

RANTES对类胰蛋白酶引起的肥大细胞蛋白酶激活受体-2表达和白细胞介素-4释放的影响

目的检测RANTES对类胰蛋白酶引起的肥大细胞白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)分泌和蛋白酶激活受体(protease activated receptor,PAR)-2表达的影响。方法 P815肥大细胞培养后,用不同浓度的RANTES、类胰蛋白酶单独或联合激发肥大细胞,不同时间点收集激发细胞和上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中IL-4水平,用流式细胞术检测P815肥大细胞表面PAR-2的表达。结果 RANTES单独作用对肥大细胞IL-4分泌无明显影响,而类胰蛋白酶单独作用则以浓度依赖方式促进肥大细胞IL-4释放(P0.01);RANTES或类胰蛋白酶单独作用对肥大细胞PAR-2表达均无明显影响(P0.25)。以RANTES预处理肥大细胞,则类胰蛋白酶促进肥大细胞IL-4释放的作用被显著抑制(P0.01);而类胰蛋白调节的肥大细胞PAR-2表达显著增强(P0.01)。结论 RANTES抑制类胰蛋白酶引起的肥大细胞IL-4分泌可能是通过RANTES增强类胰蛋白酶调节PAR-2表达而实现。     

小鼠FOXP3-siRNA慢病毒载体的构建及其对小鼠动脉粥样硬化的影响

目的:构建小鼠FOXP3基因特异性siRNA慢病毒载体,并对其进行功能性研究.方法:根据GeneBank提供的小鼠FOXP3cDNA序列,设计4条RNA干扰靶点序列,制备双链DNA oligo,与制备好的双酶切慢病毒载体连接,再转入细菌感受态细胞DH-5a,行PCR鉴定出阳性克隆并测序,制备成FOXP3-siRNA慢病毒载体,利用Western-blot方法对构建的载体进行功能性研究;将载体通过尾静脉注入小鼠体内,观察其对小鼠动脉粥样硬化形成的影响.结果:构建的小鼠FOXP3基因siRNA慢病毒载体,经PCR和DNA测序证实与设计完全一致,并对Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞有显著敲减效应;其能显著促进动脉粥样硬化形成.结论:体内外实验表明,成功构建了小鼠FOXP3基因的特异性siRNA慢病毒载体.     

小干扰RNA 沉默Toll样受体4表达对慢性温和应激 ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞TLR 4/ NF-κB途径基因表达的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默Toll样受体4(TLR4)基因对慢性温和应激ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞促炎症细胞因子表达的影响.方法 针对小鼠TLR4基因设计2条siRNA和一条无关序列,再据每一序列合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-H1.1/Adeno相连,转染293A细胞,实时荧光PCR筛选有效的一条siRNA,经腺病毒颗粒包装与病毒扩增并感染293A细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,检测病毒滴度.120只雄性ApoE-/-小鼠随机分为三组:(1)慢性温和应激组;(2)慢性温和应激+siRNA组(10 μL/只,尾静脉注射,每5日一次);(3)慢性温和应激+腺病毒空载体组.每组ApoE-/-小鼠40只,实验动物都以高脂、高胆固醇饲料喂养,分别在接受慢性温和应激0、4、12周后3个时间点处死动物,收集小鼠腹腔单核巨噬细胞,以Western Blotting方法检测其TLR4和核因子κB(NF-κB)蛋白表达,ELISA法检测腹腔单核巨噬细胞培养上清液白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α表达.结果 转染siRNA1和siRNA2后的292A细胞中TLR4 mRNA表达水平较空白对照组分别下降56%和67%,逐孔稀释滴度测定法测定的病毒滴度为3.4×1014 TU/L;遭受4、12周慢性温和应激后,ApoE-/-小鼠血浆中皮质醇激素显著升高,但在同一时间点内,各组ApoE-/-小鼠血浆皮质酮激素浓度相比,差异没有统计学意义(P>0.05);与同一时期慢性温和应激组相比,siRNA组腹腔巨噬细胞TLR4和核因子κB蛋白表达水平明显降低 (均P<0.05),其培养细胞上清液中的白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α含量显著减少(P<0.01).结论 siRNA沉默TLR4基因能有效抑制TLR4 /NF-κB-IL-1β 和肿瘤坏死因子α的表达,提示TLR4/ NF-κB途径在慢性温和应激诱导的慢性炎症应答中可能有着重要作用.     

负向调控调节性T细胞对小鼠动脉粥样硬化形成的影响

目的通过干扰FOXP3基因来研究负向调控天然调节性T细胞对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响。方法构建FOXP3-siRNA慢病毒载体和获取Foxp3hight+CD4+CD25+Treg细胞分别通过尾静脉注入不同组小鼠体内;利用流式细胞仪检测小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞数目;利用ELISA法检测各组脾细胞炎性因子浓度;取小鼠升主动脉动脉行病理分析其粥样斑块大小。结果注入FOXP3-siRNA慢病毒载体的小鼠CD4+CD25+Treg细胞数目减少,动脉粥样斑块面积显著增大。而注入Foxp3hight++CD4+CD25+Treg细胞则相反,小鼠CD4+CD25+Treg细胞数目增加,动脉粥样斑块面积减小。结论负向调控天然调节性T细胞能促进动脉粥样硬化的形成。     

酮替芬对小鼠病毒性心肌炎的作用研究

目的研究肥大细胞膜稳定剂酮替芬对脑心肌炎病毒（EMCV）心肌炎的作用。方法4周龄DBA／2小鼠经腹腔接种EMCV制成病毒性心肌炎模型,评价灌胃给予酮替芬对小鼠病毒性心肌炎的作用。观察小鼠在接种EMCV后14d生存率的变化。小鼠心肌切片HE、Masson trichrome染色,观察心室肌坏死和炎症细胞浸润面积的变化。荧光定量RT—PCR检测小鼠心脏促炎细胞因子（IL-6、TNF—α）和肥大细胞蛋白酶类胰蛋白酶及糜蛋白酶（mMCP-4、mMCP-5、mMCP-6）mRNA表达。结果酮替芬治疗使小鼠的14d生存率明显改善（75％比25％,P〈0．01）;小鼠心脏／体重比值显著改善（P〈0．05）;小鼠左心室坏死和炎症细胞浸润面积明显减少（P〈0．05）;IL-6、TNF—α、mMCP－4、mMCP－5及mMCP－6mRNA的表达明显下调（P〈0．05）。结论酮替芬可改善EMCV心肌炎小鼠的心肌炎症和生存率,其作用机制可能与下词心肌促炎细胞因子和肥大细胞特异蛋白酶类胰蛋白酶和糜蛋白酶的表达有关。     

ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变中稳定斑块组织因子的表达

目的:研究稳定斑块组织因子(TF)活化表达及在血栓形成中的作用。方法:建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的动物模型,一期凝固法检测小鼠血浆TF特异性的促凝活性,光镜和电镜观察稳定斑块病变,免疫组化SP法检测小鼠稳定斑块TF的蛋白表达,原位杂交法检测小鼠稳定斑块TF mRNA表达。结果:ApoE-/-小鼠血浆促凝活性显著增加(P<0.01),并随着诱发斑块时间的延长呈上升趋势,抗TF单抗能显著抑制血浆促凝活性(P<0.01);实验小鼠的病变为稳定斑块,电镜下,ApoE-/-小鼠可见完整的血管内皮细胞,在内皮完整的血管内有血小板的聚集;不同狭窄程度的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变部位TF的表达差异有统计学意义(P<0.01),TF的表达随着粥样硬化病变的进展而增强,TFmRNA与TF蛋白表达一致。结论:TF可能通过活化和释放启动凝血过程,导致血栓的形成;TF不仅是粥样硬化导致动脉损伤的结果,还可能是促进动脉粥样硬化病变的重要原因。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和尿激酶型纤溶酶原激活物在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块中的表达

目的探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)在载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块中的表达,并探讨两者的相互关系。方法研究对象采用ApoE-/-小鼠,共喂养18周,分别于6周、10周、14周和18周4个时间点处死小鼠行HE染色切片观察动脉粥样硬化斑块形态;并采用RT-PCR及Western blot检测主动脉粥样硬化斑块内EMMPRIN和uPA的表达。结果成功建立动脉粥样硬化模型;在主动脉粥样硬化斑块中检测到EMMPRIN和uPA表达均增高,与普通饮食组比较有统计学意义(P<0.05)。EMMPRIN和uPA表达随喂养时间延长而增高。结论 EMMPRIN和uPA在ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块中随着斑块病变程度的严重性增加表达增高,两者可能共同参与粥样硬化斑块的发生发展过程。     

JAZF1基因过表达对ApoE~(-/-)小鼠脂代谢及动脉粥样硬化的影响

目的探讨JAZF1基因过表达对ApoE-/-小鼠脂代谢及动脉粥样硬化(AS)的影响。方法将48只雄性ApoE-/-小鼠随机分为:高脂+空载(GF组)及高脂+JAZF1质粒组(JAZF1组)、高脂+生理盐水组(HF组)。检测各组血脂、生化指标、组织脂质含量、粪便胆汁酸及主动脉内膜粥样硬化病变。采用[1-14 C]醋酸盐腹腔注射,免疫荧光观察JAZF1基因过表达对ApoE-/-小鼠肝脏TC合成代谢及斑块巨噬细胞聚集的影响。结果JAZF1组肝脏JAZF1表达以及HDL-C/TC高于HF、GF组(P均0.05),而FBG、FIns、TC、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、动脉粥样硬化指数(AI)、血脂综合指数(LCI)和肝脏TC含量低于HF、GF组(P均0.05);与HF组和GF组比较,JAZF1组血管内膜脂质堆积减少,主动脉内斑块泡沫细胞聚集较少,斑块面积、斑块面积/管腔面积、主动脉粥样斑块内巨噬细胞CD68表达、肝脏14 C标记TC放射活性及肝和小肠14 C标记TC放射活性降低(P0.05或P0.01)。结论 JAZF1基因过表达可减少ApoE-/-小鼠肝脏TC含量,并抑制TC合成,改善脂代谢,抑制巨噬细胞在斑块内的聚集,减轻和延缓AS的形成。     

EMRE在高糖环境中的变化对心肌细胞凋亡机制的研究

目的 观察db/db糖尿病小鼠心肌细胞及高糖环境诱导下的H9c2心肌细胞中EMRE分子表达水平的变化,探究EMRE分子的表达变化对糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的影响。方法 (1)选取db/db糖尿病小鼠和野生型(WT)小鼠各6只,分别饲养18周,利用蛋白质印迹法、免疫组织化学法及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测小鼠心肌细胞中EMRE的表达水平;小动物超声仪检测小鼠的心脏功能。(2)将购买来的H9c2心肌细胞随机分为四组,即正常组(NG,培养基中含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,培养基中含33 mmol/L葡萄糖)、高糖+阴性对照组(HG+NC siRNA,培养基中含33 mmol/L葡萄糖+阴性对照siRNA)、高糖+转染EMRE组(HG+EMRE siRNA,培养基中含33 mmol/L葡萄糖+转染EMRE siRNA),培养24 h,采用蛋白质印迹法检测四组实验细胞中EMRE、凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9、细胞色素c(Cyto-c)以及凋亡拮抗蛋白MCL-1表达情况;利用流式细胞术检测细胞凋亡水平;ATP检测试剂盒检测各组细胞线粒体...     

多聚ADP核糖合成酶抑制剂降低高同型半胱氨酸血症诱发ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积

目的:检测多聚ADP核糖合成酶[Poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]抑制剂3-aminobenzamide (3-AB)是否能够降低由高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia, Hhcy)诱发ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的斑块面积.方法:健康6周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为普通饮食组(n=30)或高甲硫氨酸饮食组(n=30),每组再分别给予隔天腹腔注射10 mg/kg 3-AB(n=20)或0.9%氯化钠(n=20),持续12周.12周末,检测血脂及血浆同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)含量,分离心脏及主动脉,测量斑块面积,检测斑块局部NADPH氧化酶亚单位p47phox含量、PARP活性及表达.结果:高甲硫氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠产生Hhcy,促进氧化应激相关p47phox表达及PARP活化,显著增加斑块面积;PARP抑制剂3-AB虽然对普食组ApoE-/-小鼠抑制效果不明显,却能在不影响血浆Hcy和脂质含量的情况下,抑制Hhcy诱导的PARP活化,显著降低其粥样斑块面积达40%.结论:PARP抑制剂3-AB显著降低Hhcy诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积,可作为有效抑制粥样斑块进程的治疗方法之一.     

RNAi沉默CCR3对变应性鼻炎嗜碱性粒细胞迁移、活化及脱颗粒的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默CC趋化因子受体(CCR)3对变应性鼻炎小鼠嗜碱性粒细胞迁移、活化及脱颗粒的影响。方法 取36只小鼠建立变应性鼻炎模型,分为对照组(经鼻滴入CCR3siRNA对照试剂)、干预组(CCR3siRNA)和模型组(生理盐水)各12只,另取12只小鼠经鼻滴入生理盐水进行正常对照(正常组)。收集小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓样本,苏木素-伊红(HE)染色鼻黏膜观察形态学变化,Western印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分别检测CCR3蛋白和mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL)-5、IL-3、类胰蛋白酶和组胺表达水平,流式细胞仪检测CD34⁺细胞水平。取体外培养的小鼠嗜碱性粒细胞,加入CCR3siRNA(CCR3siRNA组)、CCR3siRNA对照试剂(CCR3siRNA对照组)和PBS液(空白组)进行培养,计算脱颗粒百分率。结果 与正常组比较,模型组、对照组和干预组鼻黏膜结构被破坏,黏膜及黏膜下层肿胀;外周血、鼻黏黏膜和骨髓CCR3蛋白及mRNA表达水平明显升高(均P<0.05),组胺...     

载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用

目的构建小鼠巨噬细胞半乳糖特异性凝集素（GSL）靶向的RNAi质粒载体,研究其对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的沉默作用。方法根据GSL核苷酸序列,合成3条特异性双链小干扰RNA（siRNA）分子,退火形成双链,分别连接到RNAi-Readyp SIREN-RetroQ-ZsGreen Vector,转化大肠杆菌得到阳性克隆,经测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BALB/c小鼠,应用实时定量PCR和免疫组化法评价siRNA载体对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的抑制作用。结果 siRNA载体对小鼠体内GSL基因的抑制率为84-96%,对巨噬细胞GSL基因的抑制率可达61.98%～83.02%。结论构建的siRNA载体能有效抑制目的基因在体内外的表达,该结果为分析半乳糖特异性凝集素在布鲁氏菌侵染过程中的功能奠定了基础。     

P物质抗血清对小鼠病毒性心肌炎的作用研究

目的:通过观察P物质抗血清对脑心肌炎病毒(EMCV)心肌炎的作用,探讨P物质在病毒性心肌炎发病机制中的作用.方法:4周龄DBA/2小鼠经腹腔接种EMCV制成病毒性心肌炎模型,腹腔注射P物质抗血清观察其对小鼠病毒性心肌炎的作用.观察小鼠在接种EMCV后14 d生存率的变化.小鼠心肌切片苏木精-伊红染色、Masson trichrome染色,观察心室肌坏死和炎症细胞浸润面积的变化.甲苯胺蓝(TB)染色显示心室肌组织内肥大细胞,观察肥大细胞密度的变化.荧光定量RT-PCR检测小鼠心脏促炎细胞因子[白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、基质金属蛋白酶(MMP-9)和肥大细胞蛋白酶类胰蛋白酶及糜蛋白酶(mMCP-4, mMCP-5, mMCP-6) mRNA表达.ELISA法检测小鼠心脏IL-6、TNF-α及MMP-9的表达.结果:P物质抗血清治疗使小鼠的14 d生存率明显改善(80%: 30%, P<0.05);小鼠心脏/体重比值显著改善(P<0.01);小鼠左心室坏死和炎症细胞浸润面积明显减少(P<0.01);左心室肥大细胞密度明显降低(P<0.01);IL-6、TNF-α、MMP-9、mMCP-4、mMCP-5及mMCP-6 mRNA的表达明显下调(P<0.05);小鼠心脏IL-6, TNF-α及MMP-9蛋白质表达减少(P<0.05).结论:P物质抗血清可改善EMCV小鼠病毒性心肌炎的心肌炎症和生存率,下调心肌促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的表达,降低肥大细胞密度及其特异蛋白酶类胰蛋白酶和糜蛋白酶的表达,表明P物质可能在病毒性心肌炎急性炎症和心室重构中起重要作用.     

慢病毒介导的重组人α1-抗胰蛋白酶在小鼠体内的表达

目的:构建重组人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)因子的慢病毒表达载体,并通过体外细胞水平和小鼠体内分析其表达情况.方法:通过RT-PCR的方法扩增出hAAT基因的编码序列,并构建重组慢病毒质粒;经体外包装后,感染鼠成纤维细胞及注射小鼠.荧光显微镜下观察GFP的表达情况,同时对收获的细胞及感染小鼠的肝脏或血浆进行Western blot、ELISA检测.结果:获得重组hAAT因子的慢病毒表达质粒pLVX-ser;包装后得到8×106TU/mL滴度的慢病毒颗粒.通过荧光显微镜下观察,显示重组hAAT因子在成纤维细胞中正常表达;对小鼠尾静脉注射病毒之后,进行hAAT因子检测,Western blot结果说明hAAT因子在小鼠体内成功表达;通过ELISA检测发现hAAT在小鼠体内的表达平均达190g/L左右,而且在慢病毒的介导下hAAT在小鼠中的表达可持续3mo以上.结论:重组慢病毒载体可高效、持续表达hAAT因子,为通过基因工程生产重组hAAT因子以及为α1-AT缺乏症的基因治疗奠定基础.     

化合物48/80对载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块的影响

目的目前,肥大细胞与动脉粥样硬化的关系研究主要是病理学观察和细胞学实验。基于此种现状,本课题拟用化合物48/80探讨肥大细胞脱颗粒与载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块的关系。方法40只10周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠给予高脂高胆固醇饲养至16周龄,随机分为2组(n=20),实验组给予腹腔注射化合物48/80(0.5mg/kg),隔日一次,共4次;对照组腹腔注射Dhank’s。第4次注射后半小时,安乐死处死动物,摘眼球取血,分离血清,采用酶法测定血清脂质含量,采用比色法测定血清类胰蛋白酶活性浓度。原位灌流固定,取主动脉置10%中性缓冲福尔马林中固定,石蜡包埋,连续切片,HE染色、甲苯胺蓝染色以及α平滑肌肌动蛋白、Mac3、VEcadherin免疫组织化学染色。HMIAs2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像分析。结果实验组血清类胰蛋白酶活性浓度明显高于对照组(0.57±0.13u/L比0.36±0.10u/L),但两组血清脂质含量无明显差异。实验组与对照组相比,主动脉外膜脱颗粒肥大细胞百分率升高(80.6%±17.8%比13.5%±4.1%,P<0.05),主动脉斑块最大横截面积增大[(1.25±0.36)×104μm2比(0.79±0.24)×104μm2,P<0.05],斑块内α平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率下降(36.2%±14.9%比69.7%±31.3%,P<0.05)斑块内Mac3阳性细胞百分率升高(58.6%±17.3%比28.5%±16.4%,P<0.05),而斑块内膜VEcadherin平均光密度减小(48±8比65±10,P<0.05)。结论化合物48/80促使肥大细胞脱颗粒,并使载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块最大横截面积增大、斑块内Mac3阳性细胞百分率升高、α平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率下降、斑块内膜VEcadherin平均光密度减小。     

血管紧张素转换酶2基因转染对内皮细胞的保护作用

目的：探讨血管紧张素转换酶2（ACE2）基因转染对内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的影响及意义。方法：实验包括体外实验与体内实验。体外实验,首先进行人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养,然后应用蛋白质印迹法检测ACE2转染对血管紧张素II刺激HUVEC产生的LOX-1蛋白表达的影响。体内实验,首先建立载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化模型。然后将20只ApoE-/-小鼠随机分为ACE2组及增强型绿色荧光蛋白组（EGFP组）,每组10只。ACE2组经尾静脉注射ACE2的复制缺陷重组腺病毒（Ad-ACE2）(2.5×109 pfu/ml),EGFP组注射等量EGFP的复制缺陷重组腺病毒(Ad-EGFP)。注射一个月后处死动物,做腹主动脉的油红O及LOX-1表达的检测。结果：体内实验与体外实验均证实ACE2基因转染抑制了内皮细胞LOX-1的表达,体内实验中ACE2组斑块内脂质含量明显低于EGFP组水平。结论：ACE2通过抑制LOX-1的表达进而抑制了动脉粥样硬化斑块的进展。     

慢病毒Hoxa3载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞迁移和血管新生的影响

目的构建慢病毒Hoxa3载体,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的转染效率,研究其对细胞迁移和血管新生的影响,并探讨Hoxa3促进血管新生的机制。方法以基因合成法从聚合酶链式反应文库获取人Hoxa3基因,酶切后插入慢病毒骨架载体,以三质粒联合转染293T细胞获得慢病毒Hoxa3载体,并进行滴度测定。转染HUVEC,获取最大转染效率。转染HUVEC后分对照组和慢病毒Hoxa3转染组,进行HUVEC迁移实验和小管形成实验,观察Hoxa3对HUVEC迁移和小管形成的影响。Western blot检测慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)和基质金属蛋白酶14(MMP-14)蛋白表达的变化。结果成功构建慢病毒Hoxa3载体,病毒的滴度为8×1011TU/L; 30 MOI慢病毒载体对HUVEC的转染效率达到99%以上。Western blot结果显示慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后Hoxa3能够有效在HUVEC中表达。与对照组比较,慢病毒Hoxa3载体转染HUVEC后显著增强HUVEC的迁移和小管形成,显著增加uPAR和MMP-14蛋白的表达(P0.05)。结论成功构建的慢病毒Hoxa3载体可促进HUVEC的迁移和小管形成,其作用机制可能为上调HUVEC的uPAR和MMP-14蛋白表达。